一起副溶血性弧菌食物中毒的病原学检验
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【摘要】目的 调查一起食物中毒事件的致病菌。方法 在排除沙门菌和霍乱弧菌后,在对十二烷基硫酸钠发现的副溶血弧菌特征菌落,用碱性蛋白胨增菌液分离培养。结果 随机抽取的 10 份标本均检出副溶血性弧菌。结论 该起食物中毒事件是由副溶血性弧菌引起,副溶血性弧菌在 1%氯化钠的碱性蛋白胨增菌液中能旺盛增长。
【关键词】食物中毒 副溶血性弧菌 病原检测
中图分类号：R155.3 文献标识码：B 文章编号：1005-0515（2011）10-350-03
【Abstract】Objectivesurvey of a food poisoning pathogen. Methods after exclusion of Salmonella and Vibrio cholerae, on twelve alkyl sodium sulfate discovered Vibrio parahaemolyticus features colony, using alkaline peptone broth culture. Results of the 10 randomly selected specimens were detected by Vibrio parahaemolyticus. Conclusion The food poisoning incident was caused by Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus in 1% Sodium Chloride Peptone Broth can exuberant growth.
【 Key words】 food poisoning Vibrio parahaemolyticus pathogen detection
2010 年6月, 邗江区北片某乡镇某饭店发生一起食物中毒事件, 患者主要症状为腹泻,排水样便、 呕吐和发热。并伴有畏寒、倦怠乏力等相同的临床症状。腹泻以水样便为主， 少数水样带黏液便。患者全部食用过盐水虾、沙虾、盐水虾、盐水鹅、虾仁、肉圆等可疑中毒食物。实验室对采送的腹泻粪便及呕吐标本 30份进行病原学检测, 结果报告如下：
1 材料与设备
1.1标本来源 采集患者肛拭 15份、剩余可疑食 物 6份 (盐水虾、沙虾、盐水鹅、虾仁、清蒸鱼、肉圆)、呕吐物 3份、厨师手指涂抹物 3份、砧板 涂抹物 3份, 共计样本 30份。
1.2设备与检测材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：冰箱:2℃~5℃；恒温培养箱：36℃士1℃, 42℃士1℃；均质器；振荡器；电子天平：感量0.lg ；无菌锥形瓶：容量500mL,250mL；无菌吸管：1mL（具0.0l mL刻度）、l0ml（具0.lmL刻度）或微量移液器及吸头；无菌培养皿：直径90mm；无菌试管：3mm×50mm、l0mm×75mm；无菌毛细管；pH计或pH比色管或精密pH试纸；酒精灯放大镜等；培养基及诊断血清 SS、TCBS科玛嘉显色平板等检测培养基，0 %、3%、6 %、8 %、10 % N a C l胨水和我萋氏血平板参照文献自制，3 %氯化钠三糖铁琼脂生化鉴定管等。
2 检测依据 对所采样品按照 GB /T 4789- 2008《食品微生物学检验副溶 血性弧菌检验》方法操作。
3 实验检测
3.1 检测步骤 样液-划线TBS、科玛嘉显色平板、3 %氯化钠三糖铁-生化；样液-3 %AP胨水-分别用增菌液划TBS、科玛嘉显色平板、3%氯化钠三糖铁-生化。对可能引起食源性疾病的各种致病菌进行增菌及分离培养。将营养肉汤管于 37℃ 培养 2h后, 转种各种致病菌的相应增菌液, 培养所需的时间, 同时接种相对应的平板进行分离。
3.2 沙门菌 将样品接种于 TTB 和 SC 中增菌, 同时直接划种于BS 琼脂平板和 H E 琼脂平板,经分离培养及生化试验 后确定排除沙门菌。
3.3 霍乱弧菌 将样品种于碱性蛋白胨水中增菌, 8 h 后划种于庆大霉素琼脂和十二烷基硫酸钠平板上, 经分离和鉴定后亦确定排除霍乱弧菌。
3.4 副溶血性弧菌
3.4.1 离培养 在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，于TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板，于36℃士1℃培养18h--24h。TCBS 平板上均有呈圆形、半透明、表而 光滑的蓝绿色菌落生长,直径 2~ 3 mm 。每板挑取 3 个可疑 菌落,划线 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板进行纯培养， 3 %氯化钠碱性胨水中可见液体变浑浊, 且液体表面有菌膜产生。在弧菌显色平板上可见湿润、扁平、紫红色菌落, 直径 2~ 5c m。
3.4.2 鉴定% 氧化酶试验: 挑取纯培养的单个菌落进行 氧化酶试验,结果呈阳性。
3.4.3 涂片镜检将菌落涂片染色镜 检,见革兰阴性, 呈弧状、 卵圆状和棒状等多形态菌, 无芽胞。
3.4.4 3%三糖铁氯化钠琼脂反应挑取纯培养的单个可疑菌落，接种3％氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，35℃士1℃培养24h观察结果，在 3%氯化钠三糖铁琼脂中的 反应为底层变黄,无气泡, 斜面颜色不变, 有动力。
3.4.5 嗜盐性试验 挑取纯培养的单个可疑菌落、分别接种于不同氯化钠浓度的胰胨水，36℃士1℃培养24h观察液体混浊清况。在无氯化钠和 10% 氯化钠的胰蛋白胨水中不生长,在含 3%和 6%氯化钠的胰蛋白胨水中生长旺盛, 在 8% 氯化钠的胰蛋白胨水中有些许生长。
3.4.6 生化试验 取纯培养物分别接种含3％氯化钠的廿露醇、赖氨酸、MR-VP培养基，36℃士1℃培养24h--18h后观察结果。生化性状见表 1。经鉴定, 确认副溶血性弧菌为此次食物中毒的病原菌，
4 检验结果
未检出沙门菌、霍乱弧菌，剩余食品中盐水虾、沙虾、清蒸鱼均检出副溶血性弧菌, 其它未检出副溶血性弧菌。
表 1 标本副溶血性弧菌生化结果鉴定
5讨论
5.1 结果分析 经查阅几年资料显示，副溶血弧菌引起食物中毒在我区未有发生，此次副溶血性弧菌食物中毒提示我区存在副溶血弧菌食物中毒的潜在和现实的危险，需引起一定重视，副溶血性弧菌是我国东南沿海地区引起食物中毒的病原体之一[1]、目前食物中毒已成为主要突发公共卫生事件之一[2]、邗江区虽然不是沿海地区，但近年由于经济条件及交通工具不断改善，海产品受人欢迎等原因，因而海产品数量也较充足，由于食品的交叉污染的可能性大，产生副溶血弧菌污染的可能性客观存在，此次副溶血性弧菌食物中毒相关食物盐水虾、沙虾、清蒸鱼均为淡水产品，说明我区存在副溶血弧菌主要污染淡水产品的状况，其具体污染渠道和现状值得关注，提示专业部门要开展相关流行病学调查，要加强农贸水产市场和饭店的管理，重点关注经营海鲜产品的经营业主，淡水产品及其它食品和海产品要分开经营和保管，减少副溶血弧菌引起食物中毒的机会，其它食品虽然未检出副溶血弧菌，但同样要加强管理。
由于副溶血弧菌在我区较少引起相关疾病和食物中毒，随着其造成现实威协的可能性不断增加，因而要加强实验室检测能力，以副溶血弧菌引起食物中毒的事件为契机，加强副溶血弧菌的检测能力的培训和提高，我区目前只能使用传统方法检测，需引进新的检测技术，以适应实验和流行病学需要。
5.2 检验操作要点 1、如果现场采样不到位或样品处理不细致，易造成不能检出，从而引发失误，因而注重采样和样品处理，采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。对采取的样品有时因受存放条件的影响（如低温冷冻或干燥时间过长等原因），使菌体处于受伤状态，故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养，但应注意为有利于细菌恢复，不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。样品经增菌8~16h后，转种平板进行分离，挑选可疑菌落，接种于含有3.5％盐的三糖铁培养基，此时挑选数目不应少于5个，尤其夏季海产和其它食品混放，相互污染严重，时有不同型别的大量细菌存在，以防漏检。2、把分离副溶血性弧菌的 TCBS琼脂中NACL含量从标准中的 1% 提高到 3% 能较好地提高副溶血性弧菌的检出率 因含3%NACLTCBS琼脂平板选择性较好对非特征性菌落生长抑制作用较强 特征性的副溶血性弧菌菌落则生长得更好 含1%NACL的TCBS琼脂平板选择性较弱 非嗜盐菌生长旺盛导致对嗜盐菌的生长有较强的抑制 例如常见的蔗糖发酵菌株产生的酸会随时间的延长而在培养基中扩散 导致这些菌落周围的琼脂甚至整个琼脂平板颜色由绿色变为黄色 当疑似副溶血性弧菌菌株被蔗糖发酵菌株产生的酸覆盖时 疑似副溶血性弧菌菌落颜色会由绿色变为黄绿色或黄色 致使特征性疑似菌落难以与其它非疑似菌落相区别影响了典型或疑似菌落的挑取以作进一步的鉴定 。
参考文献
[1] 何连生 徐淳行 张大帆等溶血性弧菌菌引起食物中毒的微生物学诊断研究[J].中国卫生检验学杂志.2006.16（5）569570
[2] 一起副溶血性弧菌食物中毒实验室检测[J].淅江预防医学2009.21（10）：51.
[3] 何晓青. 卫生防疫细菌检验 [M]. 北京: 新华出版社,1989: 479~ 503.
[4] 杨履渭. 微生物学与检验技术 [M] . 广州: 广东科技出版社, 1986: 579~ 580.