糜蛋白酶微生物限度检查法的验证
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摘 要 目的：对糜蛋白酶微生物限度检查法进行验证。方法：选用适宜的稀释剂溶解糜蛋白酶作为供试液，分别用平皿法与薄膜过滤法对糜蛋白酶进行微生物限度检查法的验证。结果：两种方法的回收率均≥70%。由于薄膜过滤法的取样量是平皿法的10倍，故微生物的检出率高于平皿法。结论：薄膜过滤法适用于糜蛋白酶微生物限度检查。
关键词 糜蛋白酶 微生物限度检查法 回收率
中图分类号：R927.11 文献标识码：B 文章编号：1006-1533（2014）19-0078-03
Validation of microbial limit test method for chymotrypsin
WANG Qi*
（Shanghai NO.1 Biochemical Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）
ABSTRACT Objective： To establish a method for microbial limit tests of chymotrypsin. Methods： An appropriate diluent was selected to dissolve chymotrypsin. The microbial limit were tested by both plate and film methods. Results： Microbial recoveries in two methods were≥70%， which showed that no inhibition of chymotrypsin to microbial growth. Microbial detection rate was higher in the film method than in the plate method since the sampling volume in the film method was 10 times larger than that in the plate method. Conclusion： The film method is suitable for the microbial limit test of chymotrypsin.
KEY WORDS chymotrypsin； microbial limit test； recovery
糜蛋白酶系自牛或猪胰中提取的一种蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质。作用、用途与胰蛋白酶相似，但比胰蛋白酶分解能力强、毒性低、不良反应小。可使黏稠的痰液稀化，便于咳出，对脓性和非脓性痰液均有效。临床上常用于创伤或手术后伤口愈合等。对糜蛋白酶进行微生物限度检查，能有效发现样品中的微生物污染水平，从而进行微生物风险评估，保证用药安全。
材料和方法
仪器
恒温培养箱（Sanyo MIR253），电子天平（JY-5002型），高压蒸汽灭菌锅（新华XG1.D型、Sanyo MLS-3750），医用电动吸引器（YX940D），生物安全柜（Esco Class II BSC），电热恒温水浴锅（HSY2-SP）。
药品、培养基和试剂
糜蛋白酶原料药（白色或类白色结晶性粉末或无定型粉末，上海第一生化药业有限公司）；营养琼脂培养基（批号：111222）和玫瑰红钠琼脂培养基（批号：110809）购自上海中科昆虫生物技术开发有限公司；硫乙醇酸盐流体培养基（批号：1109262）和改良马丁培养基（批号：111121）购自北京三药科技开发公司；0.9%无菌氯化钠溶液；pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。培养基在使用前按厂方说明书要求高压灭菌，试剂在使用前于121 ℃灭菌30 min。
菌种与菌液制备
细菌计数验证用菌株为：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26003，大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44102，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63501；霉菌、酵母菌计数验证用菌株为：白色假丝酵母（Candida albicans） CMCC（F）98001，黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98003。以上菌种均由上海市食品药品检验所提供。参照中国药典方法培养菌种，制备菌悬液或孢子悬液[1]。
验证方法
供试液的制备
共取3个不同批号产品对微生物限度检查方法进行平行试验。
取供试品10 g加入到100 ml pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中[1]附录104，混匀后，作为1∶10供试液。
平皿法
取供试液1 ml，分别加入上述5种50～100 CFU/ml的试验菌株1 ml，分别倾注15～20 ml营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，平行制备2个平皿，按文献[1-2]规定的温度和时间培养作为试验组；同法测定相应加入的试验菌菌落数，作为菌液组；测定供试液本底菌菌落数，作为供试液对照组。培养后对菌落计数。回收率（%）=[（试验组平均菌落数-供试液对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数]×100%）[2-3]。
薄膜过滤法
取供试液10 ml，微孔滤膜（混合纤维素酯膜，孔径0.45 mm，直径50 mm，上海半岛实业有限公司）过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液50 ml冲洗玻璃壁上残留的供试液，分别加入上述5种50～100 CFU/ml的试验菌1 ml，抽滤，取膜，贴于相应的培养基上，按中国药典2010版规定的温度和时间培养[1-2，5]，平行制备2个平皿。培养后对菌落计数，并计算回收率。
结果
平皿法检测
平皿法检测结果见表1。
由表1可知，采用平皿法进行验证时，5种试验菌的回收率为97.2%～103.2%，均大于药典规定（70%），表明糜蛋白酶对其无抑制作用。但由于3批糜蛋白酶采用平皿法检验时均未检出微生物，考虑到供试液取样量的多少可能影响微生物的检出率[4]，所以扩大取样量，采用薄膜过滤法进行验证。
薄膜过滤法检测
薄膜过滤法检测结果见表2。
试验结果表明，同样3批糜蛋白酶分别采用平皿法和薄膜过滤法进行方法验证，试验组的细菌回收率为92.1%～108.4%，但由于取样量的不同，本底样品的微生物检出率有明显的差异。采用平皿法时，3批糜蛋白酶均未检出微生物，但采用薄膜过滤法时，3批糜蛋白酶均有一定量的微生物生长[6-7]。
样品测定
采用经过验证的薄膜过滤法对5批糜蛋白酶进行微生物限度检查，结果见表3。
讨论
对糜蛋白酶进行微生物限度检查法的验证，有助于对其原料药进行微生物风险评估。由试验结果表明，两种检测方法中糜蛋白酶均无抑菌作用。
两种方法的检测结果表明薄膜过滤法的微生物检出率明显高于平皿法，其原因是两种方法的取样体积不同（平皿法1 ml，薄膜过滤法10 ml）。考虑到微生物在糜蛋白酶样品中可能是不均匀分布的，故采用薄膜过滤法能较为准确、有效地反映出糜蛋白酶样品中污染的微生物数。
之所以对糜蛋白酶样品进行微生物限度检查，主要考虑到原料药也是导致微生物污染的主要途径之一。要满足成品的微生物污染控制，还需要结合更多生产过程的控制来进一步保证产品的质量。
参考文献
国家药典委员会. 中华人民共和国药典2010年版（二部）[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2010： 附录108-109.
国家药品生物制品鉴定所. 中国药品检验标准操作规范2010年版[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2010： 356-358.
苏德模. 最新药品微生物检验分析实用手册[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2012： 183-185.
陈岩松. 影响药品微生物限度检验的因素分析[J]. 健康必读（中旬刊）， 2012， 11（12）： 136.
闵红， 韩纯洁， 杨彬. 2种剂型甲芬那酸制剂微生物限度与控制菌方法的比较[J]. 西北药学杂志， 2012， 27（6）： 576-578.
姚华， 潘庭峰. 2种原料药微生物限度检查方法验证[J]. 淮海医药， 2012， 30（6）： 541-542.
朱智峰. 美洛昔康微生物限度检查方法的验证[N]. 江苏经济报， 2010-07-17（B04）.
（收稿日期：2014-06-06）