光动力疗法对人工口腔生物膜致龋变形链球菌抑制作用的研究
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[摘要] 目的 探讨光动力疗法对口腔生物膜致龋变形链球菌抑制作用。 方法 选择40颗新鲜健康恒牙标本制备成釉质块，随机分为4组每组10块釉质块，依此置入人工唾液孵育形成人工获得性膜，再置入变形链球菌液孵育人工致龋，单纯HMME组，单纯使用20 μg/mL HMME孵育；单纯激光组，单纯采用激光照射；光动力组，20 μg/mL HMME溶液孵育后进行再激光照射；阴性对照组，采用生理盐水处理。检测菌斑生物膜变形链球菌菌落数及抗菌率、变形链球菌代谢产物、人工龋釉质块表面显微硬度评价各组抗菌作用及对釉质质量的影响。 结果 各组菌落数和抗菌率差异均有统计学意义（P < 0.05），光动力组菌落数最少，抗菌率最高。各组终末pH值和pH值差异均有统计学意义（P < 0.05），光动力组终末pH值最高，pH值最小。各组人工龋釉质块表面显微硬度差异有统计学意义（P < 0.05），光动力组人工龋釉质块表面显微硬度最高。 结论 光动力疗法对人工龋模型生物膜致龋变形链球菌抑制作用明显，抑制变形链球菌产生代谢酸，保护牙釉质提高抗龋能力，是一种有效的防龋方法，具有广泛的应用前景。
[关键词] 光动力疗法；口腔生物膜；人工致龋；变形链球菌；光敏剂
[中图分类号] R781.1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）30-0021-03
龋病是最常见的口腔科疾病，口腔常在菌在多种因素作用下引起的感染性疾病，不仅影响口腔健康，与心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤等疾病的发生发展都有密切联系[1]。口腔生物膜是唾液蛋白吸附牙面形成的一种生物膜，牙菌斑是由于细菌感染在口腔生物膜内滋生产酸而形成细菌性生物膜，溶解牙釉质导致牙矿物质流失，是龋病的直接原因。因此，抑制牙菌斑细菌活力和代谢是防治龋病的重要手段，光动力疗法是利用可见光、近红外或紫外光驱动，通过在生物组织中的光敏剂退激产生激发态单态氧导致多种生物分子氧化产生光动力，对于致病菌具有强烈的杀灭作用。血卟啉单甲醚（HMME）是第二代光敏剂，具有结构稳定、光敏剂化力强、光敏期短等优势，国外研究认为应用于光动力治疗细菌性疾病效果较好[2]。本研究对光动力疗法对人工口腔生物膜致龋变形链球菌抑制效果进行评价，并对其机制进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
2012年2～11月收集正畸减数治疗拔除的年轻健康恒牙40颗，均排除龋、裂纹、菌斑。实验菌株为中国科学院北京菌种保藏中心提供的变形链球菌（S.mutans，血清型C，ATCC25175）。
1.2 主要试剂和仪器
胰蛋白胨大豆肉汤培养基由中国检验检疫科学研究院提供，血卟啉单甲醚（HMME）购自上海复旦张江生物医学公司。紫外分光光度计（UV-2800A型，美国UNICO公司）、电热培养箱（DNP9052型，杭州蓝天化验仪器厂）、低速离心机（ALLEGRA X-12型，美国BECKMAN）、显微硬度计（432SVD型，美国Wilson公司）、半导体激光器（635 nm波长，美国IPS公司）。
1.3 方法
1.3.1 釉质块制备及人工获得性膜形成[3] 将所收集新鲜恒牙标本以PBS超声清洗5 min，截根保留牙冠，纵劈为颊面釉质块，医用酒精浸泡消毒，以颊面4 mm×4 mm区为开窗区，余部位采用丙烯酸树脂包埋，仅暴露开窗区，再放入医用酒精浸泡消毒24 h。根据文献配方制备人工唾液，将完成消毒的釉质块放入，置于电热培养箱37℃培育24 h，使釉质表面形成人工获得性膜。
1.3.2 细菌复苏和培养及菌斑生物膜形成[4] 变形链球菌菌种在37℃厌氧复苏48 h，置于胰蛋白胨大豆肉汤培养基继续37℃厌氧培养24 h，涂片确定纯培育则室温下2 500 r/min离心15 min，提取细菌，调制菌液浓度为1×108 CFU/mL。将形成人工获得性膜的釉质块置入由胰蛋白胨大豆肉汤培养液和菌液按5∶1混合液中37℃厌氧孵育10 d，每48小时更换新配置混合液，形成人工龋。
1.3.3 分组抗菌处理 40块釉质块随机分成单纯HMME组（1组）、单纯激光组（2组）、光动力组（3组）和阴性对照组（4组）等4组各10块。单纯HMME组：置于20 μg/mL HMME溶液37℃厌氧孵育2 h；单纯激光组：采用532 nm激光照射90 s，光斑直径1 cm，功率密度0.14 W/cm2；光动力组：20 μg/mL HMME溶液37℃厌氧孵育2 h，再采用532 nm激光照射90 s，光斑直径1 cm，功率密度0.14 W/cm2；阴性对照组：采用生理盐水处理釉质块90 s。均于菌斑生物膜制备过程中更换培养液时进行操作，各操作5次。
1.4 菌斑生物膜变形链球菌菌落数及抗菌率检测[5]
采用平板细菌计数法检测各组人工龋菌斑生物膜的变形链球菌计数，将各组釉质块加入2 mL生理盐水，震荡器震荡混旋5 min，梯度稀释至105 CFU/mL，取100 μL均匀涂布于胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基，37℃厌氧培养48 h，计数菌落数。活菌数（C）=菌落数×稀释倍数×100，抗菌率（Rn）=（C4-Cn）/C4×100%（n=1，2，3）。
1.5 菌斑生物膜变形链球菌代谢产物检测[6]
各组取出釉质块后，加入1 mL生理盐水，震荡器混旋5 min，3 000 r/min离心15 min，取上清，采用酸度计测定上清液中终末pH值，变化pH值（pH）=7.0-终末pH值。
1.6 人工龋釉质块表面显微硬度测定
将釉质块固定于载玻片上，压平，采用显微硬度计，维氏压头施加0.49 N，10 s，测定开窗区3点硬度，间隔300 μm，取平均值作为釉质块表面显微硬度。
1.7 统计学处理
数据采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析，计数资料采用率表示，采用χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组抗菌作用比较
各组菌落数和抗菌率差异均有统计学意义（P < 0.05），光动力组菌落数最少，抗菌率最高，其次为单纯激光组，单纯HMME组和阴性对照组差异并不显著，见表1。
表1 各组菌斑生物膜变形链球菌菌落数及抗菌率比较
2.2 各组对菌斑生物膜变形链球菌代谢产物影响
各组终末pH值和pH值差异均有统计学意义（P < 0.05），光动力组终末pH值最高，pH值最小，其次为单纯激光组，单纯HMME组和阴性对照组差异并不显著，见表2。
表2 各组菌斑生物膜变形链球菌代谢酸pH值比较（x±s）
2.3 各组对釉质块表面质量的影响
各组人工龋釉质块表面显微硬度差异有统计学意义（P < 0.05），光动力组人工龋釉质块表面显微硬度最高，其次为单纯激光组，单纯HMME组和阴性对照组差异并不显著，见表3。
3 讨论
变形链球菌是主要的致龋口腔常在菌，属革兰阳性菌。口腔致龋菌多为革兰阳性菌，革兰阳性菌对光动力疗法较革兰阴性菌敏感[7]。本研究进行口腔菌斑生物膜的制备，选择新鲜健康恒牙作为釉质块标本，配制人工唾液，避免全唾液收集可能存在的污染和病原体残留，保证了人工生物膜的稳定性和可靠性[8]；通过在人工唾液中37℃厌氧孵育创造人工口腔环境，使唾液蛋白和糖蛋白吸附与釉质块表面形成体外人工生物膜模型，浸泡菌液中使变形链球菌黏附和聚集于人工生物膜，持续滋生形成众多菌落，形成菌斑生物膜模型，此法技术成熟，制备的菌斑生物膜模型成功率和稳定性高[9]。菌斑生物膜一旦形成，其内的变形链球菌便开始产生代谢酸，釉质表面形成破坏，致龋菌的生物学活性增强，且抗酸休克、抗杀灭力较游离状态提高。以往单纯的抗菌药物治疗无法有效杀灭致龋菌，还极易产生耐药性，治疗效果不稳定，还可能产生全身的不良反应[10]。光动力疗法是局部短时间的治疗，不产生耐药性，也不会产生全身反应，具有一定的优势[11]。
本研究将制备成功的釉质块分别采用4种方式处理，并设计了阴性对照组，光动力疗法是光敏剂与激光的结合反应产生的抗菌作用，为考察光动力疗法的效果，将光敏剂HMME和激光单独使用，结果显示，在阴性对照组4 mm×4 mm的釉质表面菌斑生物膜中变形链球菌在10 d的培养期内形成大量菌落，釉质块表面形成早期龋病状态，单纯HMME在菌斑生物膜培养过程中每48小时处理1次，并不能明显减少菌落数，同样存在着较明显的龋病状态，无明显抗菌作用；单纯低能量激光在10 d培养期每48小时照射1次，有一定的抑制菌群生长的作用，但效果并不显著，而高能激光可能对牙釉质及人体组织造成伤害，因此，单纯低能量激光并不具有明显的抗致龋菌的作用；光动力组将光敏剂和低能量激光结合，抗菌率高达99.64%，菌落计数显著降低，仅为（0.61±0.02）CFU/mL，说明在激光与光敏剂的退激作用下释放出单态氧是杀灭致龋菌的主要机制，强烈的氧化作用使变形链球菌等致龋菌结构破坏、蛋白质氧化，迅速失活及死亡，产生很强的光动力杀灭作用，是致龋菌无法形成有效的牙菌斑[12]。
致龋菌分解代谢食物中的糖，并在短时间内代谢产生大量乳酸等有机酸，使菌斑生物膜pH值持续降低，当低于5.0时对牙体产生腐蚀，使之脱矿，是其致龋的关键[13]。本研究通过对各组代谢物pH进行检测，结果显示，阴性对照组终末pH值已较初始pH值（7.0）显著降低，单纯HMME组和单纯激光组并未较阴性对照组有明显的改善，而光动力组终末pH值则无显著降低，pH值最小，验证了光动力疗法对致龋菌的强烈抗菌作用使之无法产生大量的有机酸破坏牙体。龋病所致的脱矿，使牙釉质表面硬度下降，降低了牙体对细菌感染和酸腐蚀的抵御能力，加速龋病的进展[4]。对比各组釉质块表面显微硬度显示，阴性对照组表面显微硬度最低，说明大量的菌落在菌斑生物膜中繁殖，产生大量有机酸，导致牙釉质的腐蚀，硬度降低，而光动力组每48小时进行一次干预，则可有效地抑制牙菌斑生成，避免釉质表面硬度降低，防止龋病的发生和发展。
光动力疗法通过低能量激光照射和光敏剂的作用释放出具有强大生物杀灭活性的单态氧，对牙釉质表面的致龋均有效杀灭，抑制菌斑生物膜形成，避免致龋菌代谢酸对牙釉质的侵蚀，保护牙釉质表面硬度。单态氧在光动力疗法防龋作用中起极其重要的作用。
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（收稿日期：2013-07-08）