冠心合剂对家兔颈动脉球囊损伤后Ⅰ型胶原表达的影响

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摘 要：目的：观察冠心合剂对兔颈动脉经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）损伤后细胞外基质Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。方法：运用球囊原位扩张、拉伤致兔颈总动脉损伤建立PTCA术后内皮损伤模型。从术前3天开始各治疗组予相应剂量冠心合剂灌胃给药，分别于2、4、6周处死动物，免疫组织化学法检测I型胶原的表达。结果：各中药治疗组内膜胶原密度较模型组降低，差异有统计学意义（P

关键词：冠心合剂；球囊损伤； I型胶原

中图分类号：R540 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2011）04-0689-03

Effect of Guanxin Decoction on Expression of Type-I collagen

in Rabbits after Carotid Artery Balloon Injury

ZHU Guang-li, ZHOU Fan, FANG Wei, WEI Li-ping, LIU Zhao

（Department of Cardiology, Guangxing Hospital Affiliated Zhejiang Chinese

Medicine University, Hangzhou 310007，Zhejiang, China）

Abstract:Objective：To observe the effect of Guanxin decoction on extracellular matrix collagen Ⅰexpression after percutaneous transluminal coronary angioplasty （PTCA） of rabbits. Methods：Endothelial injury models were established by using in-situ balloon expansion and strain-induced injury of rabbit carotid artery. The Guanxin decoction groups were fed correspondingly does 3 days before the operation. All the animals were sacrificed at the end of the 2ed, 4th and 6th weeks respectively and operated carotid arteries were obtained. Immunohistochemical Strept Avidin-Biotin complex （SABC） staining were used for observing arterial morphology and intimal collagen density. Results：The Guanxin decoction groups have lower levels of intimal hyperplasia and intimal collagen （P

Key words:Guanxin Decoction Balloon Injury Type-I collagen

经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA） 已成为冠心病心肌血管再通的重要手段，但术后再狭窄已成为影响其疗效的主要因素。血管组织中胶原增生是引起病变的主要因素，其参与了再狭窄的形成过程【sup】［1］【/sup】。本研究通过建立在体兔颈动脉球囊损伤模型，采用免疫组织化学方法，观察冠心合剂对实验性动脉球囊损伤后Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

健康纯种雄性新西兰大白兔92只, 体重1.8～2.3kg，由浙江中医药大学动物中心提供。

1.2 主要实验药品及试剂

冠心合剂（黄芪30g，蒲黄20g，五灵脂20g），将各药加水煎煮2次，第1次1.5h，第2次0.5h，浓缩成2g/mL的生药煎剂（杭州市中医院制剂室制备）。戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司）；青霉素钠（华北制药有限公司）；SABC一抗、山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体（武汉博士德公司）。

1.3 主要实验器材

球囊囊导管（上海微创医疗器械有限公司）；JM2005型AO石蜡切片机（德国莱卡公司）；OLMPUS光学显微镜（日本Olympus公司）；Image Pro Plus 6.0图像分析软件（美国Media Cybernetics公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组与给药 将新西兰大白兔随机分为冠心合剂大剂量组（A组）、冠心合剂中剂量组（B组）、冠心合剂小剂量组（C组）、假手术组（D组）、模型组（E组），从术前3天开始每日灌胃给药，A、B、C组分别予成人20倍［冠心合剂14mL/（kg・d）］、10倍［冠心合剂7mL/（kg・d）］、5倍［冠心合剂3.5mL/（kg・d）］剂量灌胃，D组、E组给予相应剂量生理盐水灌胃，分别于2、4、6周处死动物，取手术侧颈动脉做标本，检测各项指标。

1.4.2 模型的建立 3%的戊巴比妥钠1mL/kg耳缘静脉注射麻醉，沿颈前正中线剪开皮肤4～5cm，游离左颈外动脉（ECA）0.5cm和左颈总动脉（CCA）3～4cm，将ECA 远心端结扎，CCA近心端用动脉夹临时夹闭后，在ECA结扎处近心端做“V”型切口，插入球囊导管至CCA，经压力泵向球囊内注入肝素生理盐水使其充分膨胀（8atm），慢速回拉球囊至颈内外动脉分叉处。回抽生理盐水后重新送回导管，反复3次，结扎ECA近心端，松开动脉夹，恢复血流，逐层缝合切口。术前静脉注射肝素0.1U/kg抗凝。术后肌注青霉素80万U预防感染，连续3天。假手术组不行球囊扩张外，余步骤同上。

2 免疫组织化学法检测I型胶原的表达

免疫组织化学染色按试剂盒说明书进行（检测试剂盒DAKO公司），Envision二步法进行免疫组织化学染色，二氨基联苯胺（DAB）显色：光学显微镜下阳性信号为淡黄色至棕褐色。每个标本2张切片，每张切片在镜下随机选取5个血管，每个目标血管各取2张切片，每张切片随机选取5个血管环，最后计算10个血管环所得的数据均值作为该标本的最终数据。采用Image-ProPlus图像分析系统测量内膜胶原面积与血管内膜面积比值（内膜胶原密度），取平均值。

3 统计学分析

正态性分布资料用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 16.0软件包, 方差齐性指标进行单因素方差分析及两两比较q检验，方差不齐的指标进行独立样本秩和检验及两两比较。P

4 结 果

4.1 镜下观察

Ⅰ型胶原镜下呈黄至棕褐色，假手术组内膜基本无增生，外膜胶原缠绕，内弹力膜连续完整，中膜主要成分为平滑肌细胞，呈梭形，走形一致，以管腔为同心圆排列；模型组2周可见血管内膜形成并增厚，排列紊乱，部分平滑肌细胞进入血管新生内膜，I型胶原的表达增加，4周时血管内弹力膜连续性中断，细胞排列紊乱，大量泡沫细胞生成，I型胶原的表达继续增加，6周出现纤维结缔组织增生，I型胶原的表达最高；冠心合剂各剂量组随时间I型胶原的表达均有所下降，结构较完整。见图1～3。

图1 假手术组6周

图2 模型组6周

图3 中药大剂量组6周

4.2 内膜胶原密度测定

表2研究表明：模型组各时间点较同时间点的假手术组、冠心合剂各剂量组内膜胶原密度显著升高（P0.05），冠心合剂大剂量处理6周组较冠心合剂其他各组各时间点Ⅰ型胶原的表达显著下降（P

表2 冠心合剂对内膜胶原密度的影响（%）

注：与同处理时间的E组比较，P

5 讨 论

动脉损伤后在新生内膜逐渐增厚过程中，动脉壁也进行着内在结构的调整，这种以动脉壁结构改变为基础的几何重塑称为血管重塑，可加重或减轻内膜增生对动脉管腔的侵蚀作用。对于血管重塑的机制研究目前还没有明确的结果，细胞外基质的变化是其可能机制之一。胶原是细胞外基质的主要成分，可引起血小板的黏附、聚集和激活并释放生长因子，并且维持血管的张力。Nagler 等【sup】［2］【/sup】报道细胞外基质与新生内膜的形成密切相关,特别是Ⅰ型胶原。Karimp【sup】［3］【/sup】等证实，胶原合成在血管内皮损伤后2天开始，30天已成为构成新生内膜的主要成份；同时，损伤早期有血管中膜平滑肌细胞向内膜迁移和增殖的过程，而此过程需要基底膜和周围基质的降解以及新的适宜环境的建立，胶原作为基底膜及细胞外基质的主要成份，在上述过程中发挥重要作用。Coats等【sup】［4］【/sup】研究也发现血管成形术后4周,动脉壁内Ⅰ型胶原含量增加，促进了VSMC 增殖和再狭窄的发生。球囊损伤后内膜及中层细胞增生高峰在第1周、第2周显著降低，而第1、2、4周观察受损血管段胶原等基质成分合成是非受损血管段的4～10倍，其含量的增加与细胞增生相一致；在细胞增生程度降低后，基质合成、蛋白积累要持续数周。葛夕洪等【sup】［5］【/sup】研究表明内膜胶原的增生一方面是内膜的重要组成成分，除对新生内膜起支持作用外，对内膜体积的增大也有作用，同时，早期增生可能对VSMC的迁移和增殖起促进作用。关于胶原的合成，虽然文献的结果在具体时间上并不完全一致，但总体趋势基本是相同的，即经历了PTCA后胶原合成先增加后逐渐恢复正常的过程。Strauss【sup】［6］【/sup】等发现ECM的积聚出现延迟，提出可能存在胶原降解和ECM间的转换，这种变化对血管壁的重塑和后期内膜的形成可能会具有重要的作用。因此胶原积聚可能是导致PTCA后再狭窄和收缩性重塑的独立因素之一。

中医对PTCA术后再狭窄的防治是多途径的，益气活血法在治疗中处于重要地位。祖国医学认为“气为血之帅，血为气之母”，气虚则血行无力，血液瘀滞于脉中，瘀血一方面是病理产物，另一方面又作为刺激因素，进一步导致气血运行不畅，从而形成恶性循环，病程得以进展。故治疗强调补中寓通、通中寓补、通补兼施，着眼于整体功能的调节，达到气盈血行、血脉通利、瘀者自然解也。

冠心合剂由大剂量的黄芪合用失笑散而成，全方以补益心脾之气为本，活化心胸之瘀滞为标，标本同治，虚实兼顾。本研究结果发现，模型对照组损伤段动脉内膜和中膜中Ⅰ型胶原表达量明显增加，证实了胶原在再狭窄中的作用。冠心合剂可抑制兔颈动脉球囊损伤后Ⅰ型胶原的表达，且作用呈一定剂量和时间依赖性。可见，冠心合剂对实验性兔颈动脉球囊损伤具有保护作用，可能与其抑制血管新生内膜增生和Ⅰ型胶原的表达有关。

参考文献

［1］ Varo N, Etayo JC, Zalba G,et al.Losartan inhibits the post 2 transcriptional synthesis of collagen type I and reverses left ventricular fibrosis in spontaneously hypertensive rats［J］. J Hypertens,1999,17（1）:107-114.

［2］ Nagler A, Miao HQ, Aingorn H. Inhibition of collagen synthesis, smooth muscle cell proliferation, and injury-induced intimal hyperplasia by halofuginone［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997,17（1）:194-202.

［3］ Karim MA, Miller DD, Farrar MA.Histomorphometric and biochemical correlates of arterial procollagen gene expression during vascular repair after experimental angioplasty［J］.Circulation，1995，91（7）:2049-2057.

［4］ Coats WD, Cheung DT, Han B,et al. Balloon angioplasty significantly increases collagen content but does not alter collagen subtypeI/IIIratios in the atherosclerotic rabbit iliac model ［J］. J Mol Cell Cardiol,1996,28（2）:441-446.

［5］ 葛夕洪,贺能树,徐锐，等.胶原在血管成形术后再狭窄中的表达和意义的研究［J］.中国介入影响与治疗学，2007,4（5）:378-382.

［6］ Strauss BH, Chisholm RJ, Keeley FW,et al.Extracellular matrix remodeling after balloon angioplasty injury in a rabbit model of restenosis［J］.Circ Res，1994，75（4）:650-658.