重组人Ⅱ型胰蛋白酶的性质及初步应用研究
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摘 要：目的研究重组人Ⅱ型胰蛋白酶的性质及初步应用。方法用米氏方程和双倒数作图法确定米氏常数Km，Vmax值，BAEE法测定胰蛋白酶活性，将胰蛋白酶用于激活羧肽酶原B及细胞消化。结果重组人II型胰蛋白酶最适反应温度30℃，最适pH 7.6，以BAEE为底物，Km和Vmax分别为12.7μmol／和212.76μmol／min。EDTA~PMSF抑制酶活性，高于50℃条件下易失活。与牛胰蛋白酶相比，重组人胰蛋白酶对羧肽酶原B有更高的激活效率，细胞消化方面二者效果基本相同。结论温度及pH是影响酶稳定性的较大因素，重组人胰蛋白酶可替代牛胰蛋白酶用于激活羧肽酶原B和细胞消化。
关键词：重组人Ⅱ型胰蛋白酶；牛胰蛋白酶：性质；应用
中图分类号：Q55.9 文献标识码：A 文章编号：1672-979X(2010)11-0384-05
盐胰蛋白酶原为胰蛋白酶的前体，在胰脏合成。在Ca2+存在条件下，胰蛋白酶原可通过肠激酶或胰蛋白酶的自身激活，断开肽链N端6位赖氨酸和7位异亮氨酸残基之间的肽键，失去一段6肽，分子构象变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶可激活酶原，成为有活性的酶。商品化胰蛋白酶主要来源于猪或牛的胰腺。
人胰蛋白酶有I型和II型2种类型，根据等电点不同，又分为阳离子型和阴离子型。我们用基因工程方法得到了重组人阴离子型胰蛋白酶原(II型胰蛋白酶)，激活后得到高活性的人源胰蛋白酶。由于胰蛋白酶在溶液中稳定性较差，容易发生自降解，使酶活性下降。本实验研究了重组人II型胰蛋白酶的稳定性及部分性质，并初步研究了酶解激活羧肽酶B酶原及在细胞消化中的应用。
1 材料
1.1 试剂
牛胰蛋白酶(Sigma)；重组人Ⅱ型胰蛋白酶-(本实验室制备)；苯甲酸-L-精氨酸乙酯(BAEE，Sigma)：其余试剂为进口或国产分析纯。
1.2 仪器
T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器公司)：FE20型pH计(梅特勒，托利多仪器公司)；EV265双向电泳仪(PS265-230V，Hoefer)
2 方法
2.1 Jm值的测定
以BAEE为底物，测定重组人II型胰蛋白酶和牛胰蛋白酶的米氏常数Km。底物BAEE的浓度范围为0.005-0.25mmol／L，用双倒数作图法，以底物浓度的倒数值为横坐标，反应速率即活性的倒数值为纵坐标做图，与x轴交点的负倒数即为Km。
2.2 重组人lI型胰蛋白酶的最适温度及最适pH
取3mL底物分别置于4，15，20，25，30，40，55，65，75℃保温1h，加入等量的重组人II型胰蛋白酶，测定酶活性。底物用不同pn的20 mmol／L乙酸钠一乙酸，Tris-HCl及GIy-NaOH缓冲液配制。测定重组人II型胰蛋白酶活性，确定最适pH。
2.3 重组人ll型胰蛋白酶与牛胰蛋白酶热稳定性和pH稳定性
将重组人Ⅱ型胰蛋白酶与牛胰蛋白酶分别配制成0.5 mg／mL溶液，分别于-20，4，15，37，50℃保温，测定不同保温时间的活性，计算失活百分比。
将重组人Ⅱ型胰蛋白酶1mL分别加入不同pH的缓冲液中，配成200 U／mL(0.3 mg／mL)溶液。缓冲液分别用50 mmol／L乙酸钠-乙酸，Tris-HCl和Gly-NaOH，pH
2.4 金属离子及化学试剂对重组人Il型胰蛋白酶与牛胰蛋白酶活性的影响
向重组人Ⅱ型胰蛋白酶液(活性860 U／mL)分别加入不同金属离子(Zn2+，Mg2+，Ba2+，Mn2+，Ca2+，Fe2+，Cu2+)1 mmol／L，4℃保温1h后测活性。重组人II型胰蛋白酶液(活性750 U／mE)分别按1％的量加入EDTA(乙二胺四乙酸)，PMSF(苯甲基磺酰氟)，DTT(二巯基苏糖醇)，SDS(十二烷基硫酸钠)，Triton x，100，4℃保温1 h后测活性。另取牛胰蛋白酶粉末按上述方法配成相同活性溶液。
取重组人II型胰蛋白酶分别加入不同浓度(0.5，1mol／L)氯化钠溶液及尿素(1.2 mol／L)溶液配制成活性为1200 U／mL溶液。4℃放置24h后测活性。另取牛胰蛋白酶粉末配成相同活性溶液，同法操作。
2.5 重组人II型胰蛋白酶酶解羧肽酶B动力学研究
取牛胰蛋白酶和实验室制取的重组人II型胰蛋白酶，按蛋白浓度比1:50将等量的2种酶加入羧肽酶B复性液(0.5mg／mL)中。间隔一定时间测羧肽酶B活’性，并留取样品检测SDS-PAGE。
2.6 重组人ll型胰蛋白酶消化细胞的初步研究
细胞消化液组成：胰酶0.5 mg／mL，EDTA 0.04 g／mE溶于PBS液中，并用盐酸调为pH 7.4。所用溶液均经高温灭菌，或者经0.22岫1滤膜过滤。
A组为牛胰蛋白酶组，AI：800 U／mL牛胰蛋白酶酶液200μL，EDTA 0.04g／nL；A2：800 U／mL牛胰蛋白酶酶液100μL，EDTA0.04g／mL。
B组为重组人胰蛋白酶组，B1：800U／mL重组人II型胰蛋白酶酶液200uL，EDTA 0.04g／mL；B2：800U／mL重组人1I型胰蛋白酶酶液100μL，EDTA0.04g／mL；B3：400U／mL重组人II型胰蛋白酶酶液200uL，EDTA 0.04g／mL。
c组为专用细胞消化液200μL，活性800 U／mL，EDTA0.04g,／mL。
将传代的鼠T3细胞传代于6孔板，加入细胞培养液培养。待细胞贴壁生长后，向6孔板分别加入上述6种试液。显微镜下观察细胞形态变化，待细胞完全脱离培养瓶时拍照并记录时间。比较细胞形态变化和完全消化所需时间。
3 结果
3.1 重组人Il型胰蛋白酶和牛胰蛋白酶Km值的测定
结果见图1。由图1A计算可知，重组人II型胰蛋白酶的Km值为12.7μmogL，Vmax为212.76μmol／min。由图1B计算可知，牛胰蛋白酶Km。值为40μmol／L，Vmax为588.23μmol／min。表现出重组人胰蛋白酶对BAEE有更高的亲和力。
3.2 最适温度及最适pH的确定
不同的测定温度测得的吸光度在5min内的变化见图2。测活温度低于30℃，吸光度变化均匀。高于30℃，5min内的吸收度随时间呈下降趋势，即酶在高于30℃条件下易失活。所以，30℃为测定重组人II型胰蛋白酶活性的最适温度。通常情况下，我们仍选择25℃的标准条件为测活温度。
pH对测定活性有很大的影响，pH7.6时酶活性最高，所以pH 7.6为胰酶测活的最适pH。见图3。
3.3 重组人II型胰蛋白酶与牛胰蛋白酶的热稳定性及pH稳定性
重组人Ⅱ型胰蛋白酶酶液置于不同温度下，活性随着时间的变化见图4A。由图4A可见，温度越低，酶活性损失越小，温度高于50℃，酶活性很快-丧失。但是，酶置于20℃的条件下，活性丧失相当快。这可能是冻融过程中蛋白构象发生变化所致。所以重组人II型胰蛋白酶的最适保存温度为4℃。牛胰蛋白酶酶液置于不同温度下，活性随着时间的变化见图4B。牛胰蛋白酶随着温度升高活性丧失很快，-20℃条件下酶液最稳定。相同时间内，牛胰蛋白酶活性丧失的速度比重组人Ⅱ型胰蛋白酶快。
重组人II型胰蛋白酶及牛胰蛋白酶在不同pH条件下活性变化见图5。由图5可见，2种酶的变化趋势基本相同。pH过低或过高都使2种酶活性降低，重组人Ⅱ型胰蛋白酶pH8～9时活性最稳定。牛胰蛋白酶对pH的耐受性要强，pH 7～10时牛胰蛋白酶活性只有较小的损失。
3.4 金属离子及试剂对胰蛋白酶活性的影响
各种试剂对酶活性的影响见表1。牛胰蛋白酶活性随着EDTA浓度上升丧失增多，1mmol／L EDTA就能使重组人II型胰蛋白酶活性丧失80％。EDTA使酶活性丧失是因酶液中钙离子被EDTA螯合，表明重组人II型胰蛋白酶活性中心的钙离子对酶活性的发挥有至关重要的作用。二者不同可能与牛胰蛋白酶含ca2+有关。PMSF对酶活性有抑制作用，因为PMSF是丝氨酸蛋白酶抑制剂，这也表明胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，活性被抑制。DTT对2种酶的活性也有很大的影响，尤其是对重组人II型胰蛋白酶。1％SDS和0.1％Triton-X100能使酶活性彻底丧失，使蛋白质发生变性。高浓度的NaCl(如0.5mol／L和lmol／L)和低浓度的Urea(如l mol／L和2 moFL)对重组人II型胰蛋白酶活性没有影响。表1不同试剂对牛胰蛋白酶及重组人胰蛋白酶活性的
3.5 重组人11型胰蛋白酶及牛胰蛋白酶用于羧肽酶原B的酶解激活
用重组人Ⅱ型胰蛋白酶酶解的羧肽酶B的最终比活性是用牛胰蛋白酶酶解样品的1.5倍。由图6可见，重组人离子型胰蛋白酶酶解羧肽酶原B在速率上优于牛胰蛋白酶。由图7可见，羧肽酶原B在加入胰蛋白酶后，逐步酶解为羧肽酶B。所以，我们通过基因工程方法制备的重组人胰蛋白酶在某些方面已经达到甚至超过了市场同类产品。
3.6 重组人Il型胰蛋白酶消化细胞初步研究结果
各组样品完全消化细胞所用时间见表2。由表2可见，在活性相同时，重组人II型胰蛋白酶完全消化细胞所用的时间较短，几乎与市场上消化细胞专用消化液所用时间相同。
细胞消化效果见图8。经过胰蛋白酶消化作用后，原来贴壁生长的T3细胞从培养瓶壁上脱离，细胞形态从扁平状变成球状，T3细胞之间出现空隙。细胞生长状态良好。
4 讨论
胰蛋白酶原具有自身活化和自身降解的特性，在真核系统中表达，很难得到完整的胰蛋白酶原，并且其活化为有活性的胰蛋白酶会对宿主细胞造成一定的毒性。因此，在毕赤氏酵母中天然牛胰蛋白酶没有成功表达 。
我们在大肠杆菌中成功的表达出人胰蛋白酶原。人胰蛋白酶原以无活性的包涵体形式表达，避免了活性胰蛋白酶对宿主细胞的毒性作用。此后通过激活作用获得活性的人源胰蛋白酶。
但是我们研究发现，重组胰蛋白酶在常温下容易失活。研究证明，阴离子型胰蛋白酶的稳定性较阳离子型胰蛋白酶稍差。我们试图通过对其自降解位点进行突变以提高其稳定性，此项研究正在进行。初步研究结果说明，我们制备的重组人II型胰蛋白酶酶解羧肽酶B的效率及效果都优于牛胰蛋白酶；消化细胞的速率也快于牛胰蛋白酶，效果与牛胰蛋白酶相当。