不同条件对母乳理化的影响

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母乳不仅含有易于新生婴儿消化的营养物质，还含有丰富的活性成分， 有帮助婴儿抵抗感染、调节免疫的作用， 是新生儿喂养的最佳选择。 然而很多情况下母乳不能及时喂养需要低温储存，一 般 短 时 间 保 存 选 择 4℃ ～ 6℃， 长 时 间 需 要－20℃甚至－70℃深低温保存 ， 但是国际上各母乳库的保存标准并不完全统一。 英国母乳库协会（The United Kingdom Association for Milk Banking，UKAMB） 推荐， 乳汁一经挤出 4℃条件下存放不应超过 24 h， －20℃条件下最长可存放 3 个月[1]； 意大利的推荐； 4℃ 3 d， －20℃ 3 个月[2]； 北美母乳库协 会 （ Human Milk Banking Association of NorthAmerica， HMBANA） 则推荐， 4℃可冷藏 8 d， －20℃可达 12 个月， －70℃则存放更长[3]。 我国尚无统一的母乳保存标准。 国内研究显示， 各种保存条件下母乳中的乳糖、 蛋白质、 脂肪等主要营养成分变化不大[4]， 但是保存后母乳的活性成分变化国内尚无相关报道。母乳中的分泌型 IgA（sIgA） 能够有效抵抗感染[5]， 维生素 C（VitC） 能抗氧化减轻炎症反应[6]， 白细胞（WBC）能吞噬病原体并分泌免疫因子。 本研究拟通过检测不同温度和保存时间下母乳中的WBC、 sIgA、 VitC 水平， 结合其 pH 值、 渗透压和细菌菌落数的变化， 从理化性质、 免疫成分及细菌生长三方面评价不同保存条件对母乳成分的影响， 探讨适宜的母乳保存方法。

1 材料与方法

1．1 母乳来源

2010 年 10 月 — 12 月间收集 30 例新鲜母乳，采集时间为产后 31．5（13．8， 56．0）d。 剔除标准包括乳母破裂或有皮肤感染者， 传染病患者，抽烟及酗酒者， 药物、 成瘾者， 患慢性疾病并需长期服药者。 本研究经上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心伦理委员会批准（SCMC-201021）， 并征得受试者同意。

1．2 方法

1．2．1 母乳采集 在室温下用母乳泵吸空一侧， 取其中 30 ～ 40 ml 母乳均分为 5 份， 以环氧乙烷灭菌的 PP 材质试管盛放。 第 1 份立即检测；第 2、 3 份放入 4℃冰箱， 分别于第 48、 72 小时检测； 第 4 份放入－20℃冰箱， 30 d 检测； 第 5 份放入－70℃冰箱冷冻， 90 d 检测。

1．2．2 标本检测 在 0 h（室温）、 48 h（4℃）、 72 h（4℃）、 30 d（－20℃）、 90 d（－70℃） 检测标本， 所有标本在采集或者室温冻融后 2 h 内检测， 检测前将乳品标本混匀。 检测内容包括 pH 值（酸度计， 雷磁 PHS-3C）、 渗透压（全自动冰点渗透压仪， 上医大仪器厂 FM-8P）、 WBC（血细胞计数仪， Sysmex）、sIgA 浓 度 （ ELISA， Blue Gene） 、 总 Vit C 浓 度（HPLC 法[7]）。 参照食品安全国家标准 ＆ 食品微生物学检验标准汇编 ＆GB 4789 系列（2010 版）中食品微生物学检验菌落总数测定标准进行细菌菌落检测。

1．2 统计学分析

以 SPSS13．0 软件分析所有数据， 正态分布的计量资料用均数 ± 标准差（x ± s）表示， 采用重复测量方差分析； 非正态分布的计量资料用中位数、四分位间距表示（M， Q）， 采用 Friedman 检验。 P ＜0．01 为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 不同保存条件下母乳物理性质变化

不同保存条件下， 母乳的 pH 值有明显下降，差异有统计学意义（P ＜ 0．01）。 相比 0 h（室温）母乳的 pH 值， 48 h（4℃）、 72 h（4℃）、 30 d（－20℃）、90 d（－70℃） 母乳的 pH 值均下降（P ＜ 0．01）。不同保存条件下， 母乳渗透压也有明显变化，差异有统计学意义（P ＜ 0．01）。 其中 4℃保存母乳的渗透压随时间延长而下降， 72 h（4℃）保存时母乳的渗透压低于 0 h（室温）、 48 h（4℃）保存的母乳， 差异有统计学意义（P ＜ 0．01）。 30 d（－20℃）保存母乳渗透压与 0 h（室温） 时一致； 而 90 d（－70℃） 保存母乳的渗透压升高， 与 0 h（室温） 母乳的差异有统计学意义（P ＜ 0．01）。 见表 1。

2．2 不同保存条件下母乳有效成分变化不同保存条件下， 母乳 sIgA、 VitC 浓 度 和WBC 均有变化， 差异有统计学意义（P 均 ＜ 0．01）。其中， sIgA 在 30 d（－20℃）、 90 d（－70℃）保存母乳中明显下降， 与 0 h（室温）比较， 差异有统计学意义 （P ＜ 0．01） ； 90 d （－70℃ ） 保 存 母 乳 较 30 d（ －20℃ ） 进一步下降 ， 差异 有 统 计 学 意 义 （ P ＜0．01）。 保存后母乳的 WBC 下降至 0 h（室温） 母乳的 30％以下， 差异均有统计学意义（P ＜ 0．01）。 4℃保存母乳的 VitC 下降最显著， 72 h（4℃） 较 48 h（4℃） 保存母乳进一步下降（P ＜ 0．01）。 见表 1。

2．3 不同保存条件下母乳细菌菌落数变化

不同保存条件对母乳中细菌总菌落数， 以及G＋菌落数、 G－菌落数均有改变， 差异有统计学意义（P ＜ 0．01）。 48 h（4℃） 保存的细菌总菌落数、 G＋菌落数、 G－菌落数与 0 h（室温）母乳的差异无统计学意义； 72h（4℃） 保存母乳的细菌总菌落数与 0 h（室温） 母乳的差异无统计学意义 ， 但 G＋菌落数较0 h （ 室温 ） 母乳下降 ， 差异有统计学意义 （ P ＜0．01）， G－菌落数则较 0 h（室温）母乳上升， 也高于48 h （ 4℃ ） 保 存 母 乳 ， 差 异 有 统 计 学 意 义 （ P ＜0．01）； 30 d（－20℃） 保存母乳的总菌落数、 G＋菌落数均下降， 与 0 h（室温）母乳的差异有统计学意义（P ＜ 0．01）； 90 d（－70℃） 保存后总菌落数、 G＋菌落数、 G－菌落数均下降， 与 0 h（室温）母乳的差异有统计学意义（P ＜ 0．01）。 见表 1。

3 讨论

目前我国 NICU 中患儿母乳喂养率低， 相当一部分原因是缺乏公认的母乳保存标准。 国外已形成完善的母乳捐献、 贮存、 供应标准， 有专业的母乳库协会， 但我国因为各方面的原因尚未建立规范的母乳库。 Meta 分析显示， 用库存母乳喂养可减少新生儿坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC） 的发生[8]， 提高母乳喂养比例 ， 促进早产儿更早达到完全肠内喂养[9]。 本研究通过观察保存条件对母乳成分的影响， 以探索母乳保存的理想条件， 促进我国母乳库的规范化建设。本次研究结果显示， 4 个不同条件保存时母乳的 WBC、 VitC 均明显下降。 Pittard 等[10]的研究证明保存后乳汁中巨噬细胞和中性粒细胞会黏附到盛放的容器壁上， 还会发生细胞溶解， 所以 WBC降低。 另有研究显示， 4℃冷藏 VitC 氧化为脱氢抗坏血酸增加， 再转变为无抗氧化活性的二酮古洛糖酸[11]。 但是 Buss 等[12]发现， 将过氧化物酶抑制剂加入母乳后能够降低 VitC 减少的程度， 所以认为 VitC 减少与乳酸过氧化物酶有关。 本次研究中母乳经保存后 pH 值均明显下降， 可能是与脂肪分解为游离脂肪酸有关[13]。 sIgA 在 4℃ 中较为稳定， －20℃、 －70℃冷冻后显著降低， 可能与蛋白分解或活性降低有关。 细菌生长方面总菌落数、 G＋菌落数逐渐减少， 而 G－菌落数在 4℃有上升趋势， 其72 h 的升高有统计学意义 ， 考虑与该温度下母乳的抑菌能力降低有关[14]。 本次研究中母乳在 4℃的变化与 Slutzah 等[15]的研究结果相似。

总的来看， 保存对母乳的物理性质、 有效成分和细菌生长有明显影响。 其中 48 h（4℃）、 30 d（－20℃）、 90 d（－70℃） 保存的母乳总菌落数、 G＋菌落数、 G－菌落数都在安全范围内， 但 4℃时 G－菌落数有增加趋势， 保存母乳中 VitC 的降解非常快。因此， 建议 4℃保存的时间不宜超过 48 h， 若需长时间保存建议选择－20℃或－70℃， 使用保存后的母乳喂养时考虑适当添加 VitC。母乳成分复杂， 且呈动态变化， 鉴于研究时间及规模有限， 我们只检测了众多母乳有效成分中的少数几项， 需要开展更深入的研究。 本次研究的结果为母乳保存提供参考依据， 并为尝试创建母乳库制订规范提供可靠的试验数据。