中脑腹侧被盖区和伏隔核内食欲素Ⅰ型受体在大鼠觅药行为表达中的作用

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【摘 要】目的：探讨中脑腹侧被盖区（VTA）和伏隔核（NAc）内食欲素Ⅰ型受体在大鼠觅药行为表达中的作用。方法：以吗啡条件性位置偏爱（CPP）表达作为大鼠觅药行为模型，88只雄性Wistar大鼠随机进入VTA干预组和NAc干预组，偏爱测试前分别在VTA和NAc内注射食欲素Ⅰ型受体（OXR1）拮抗剂SB334867（VTA:1,5μg; NAc:1,3μg）或溶剂（DMSO），考察其对CPP表达的影响。采用单因素方差分析比较了各组间的偏爱值。结果：吗啡CPP表达前VTA注射5μg SB334867组动物的偏爱值（73.6±81.7）低于溶剂处理组（183.5±30.4）；吗啡CPP表达前NAc注射SB334867组动物的偏爱值（229.6±72.9和260.6±53.9）与溶剂处理组（224±52.1）之间无显著差异。结论：食欲素通过激活VTA内食欲素Ⅰ型受体促进药物相关环境线索诱发的大鼠觅药行为表达，而NAc内的食欲素Ⅰ型受体不参与觅药行为表达。本研究为揭示食欲素参与觅药行为表达的神经机制提供了线索。

【关键词】 药物成瘾；条件性位置偏爱；食欲素；觅药行为；中脑腹侧被盖区；伏隔核

中图分类号：R595.4、R749.61 文献标识码：A 文章编号：1000-6729(2009)006-0441-06

doi:10.3969/j.issn.1000-6729.2009.06.017

The Roles of OrexinⅠReceptor in Ventral Tegmental Area and Nucleus Accumbens in

Drug-seeking Behavior Induced by Morphine

BAI Yun-Jing1，2,HUANG Yan-Bei1，2,WEI Chu-Guang1，2,PENG Yong-Hua1，2,LI Yong-Hui1 ,Sui Nan1@

1The key lab of mental health,Institute of Psychology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China

2Graduate School of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100087,China

@ Corresponding author,Email:suin@psych.省略

【Abstract】Objective:To investigate the roles of OXR1 in the ventral tegmental area(VTA)and nucleus accumbens(NAc)in drug-seeking behavior induced by morphine.Methods:Drug-seeking behavior in rats was measured with the model of expression ofconditioned place preference(CPP).Eighty-eight male Wistar rats were randomly incorporated into the VTA-treated groups and NAc-treated groups.The OXR1 selective antagonist SB334867(VTA:1,5μg; NAc:1,3μg)or vehicle(Dmethyl Sulfoxide)were microinjected into the VTA and NAc respectively before CPP expression tests.The one-way ANOVA was used to compare the preference scores among groups.Results:The preference score was significantly reduced in animals microinjected with 5μg SB334867 compared with that in animals microinjected with vehicle into the VTA before CPP expression test ［(73.6±81.7)vs.(183.5±30.4),P

【Key words】 drug addiction; conditioned place preference; orexin; drug-seeking behavior; ventral tegmental area; nucleus accumbens

药物成瘾（drug addiction）是一种慢性复发性脑疾病。反复用药导致强烈的药物渴求和强迫性觅药行为，对个体、家庭和社会造成巨大损失。因而，揭示强迫性觅药行为的脑机制变得极为迫切。在临床或实验室中，药物、用药相关线索和应激都是引发个体产生觅药动机和觅药行为的主要因素［1］。条件性位置偏爱（conditioned place preference,CPP）的表达是用药相关环境线索诱发的觅药行为（drug-seeking behavior），体现了动物对药物奖赏的渴求［2］。

食欲素（orexin）是下丘脑分泌的一种神经肽，其神经元特异性分布于外侧下丘脑以及邻近脑区［3-4］。食欲素有2种形式：orexin A和orexin B，食欲素受体亦有2种：Ⅰ型受体（OXR1）和Ⅱ型受体（OXR2）。食欲素神经元投射相当广泛，包括介导奖赏和动机功能的中脑边缘多巴胺系统［5-6］，这使得人们关注食欲素在药物成瘾中扮演的角色［7］。事实上，研究发现食欲素在觅药行为中发挥重要作用。如，吗啡CPP表达伴随着外侧下丘脑内orexin A神经元激活（c-Fos表达增加），而外周注射OXR1拮抗剂SB334867可阻断吗啡CPP表达［8］。与酒精有关的信号出现时，下丘脑orexin神经元也被激活［9］。然而，关于orexin促进觅药行为表达的脑区机制研究很少。

中脑腹侧被盖区（ventral tegmental area,VTA）和伏隔核（nucleus accumbens,NAc）是中脑边缘多巴胺系统的核心脑区，反复用药导致VTA-NAc通路发生的适应性变化是强迫性觅药行为的重要神经基础。Orexin神经元与上述2个脑区均有密切神经联系［5-6,10］，并对VTA-NAc通路起兴奋性调节作用［11-12］。本研究目的是考察orexin神经元是否通过VTA和NAc参与觅药行为表达。目前已有的研究都关注OXR1在药物成瘾中的作用，尚无商品化的OXR2拮抗剂可能是部分原因，因而，本实验以CPP表达为觅药行为表达模型，以分别阻断VTA和NAc内OXR1来探讨2个脑区内的orexin A在觅药行为表达中的作用。

1 对象与方法

1.1 实验动物

雄性Wistar大鼠88只（购自维通利华实验动物技术有限公司），初始体重（240±20）g，在25 cm×22.5 cm×30 cm的不锈钢笼中单笼饲养，自由饮水、进食。光周期为8：00~20：00时，实验室温度控制在20℃~24℃，相对湿度为40%~60%。适应性饲养1周后进入实验。适应期间每天抚摩捉拿动物，使其适应实验主试人员的操作。

所有大鼠被分为中脑腹侧被盖区（VTA）干预组和伏隔核（NAc）干预组。VTA干预组和NAc干预组又各自分为5个亚组：盐水训练溶剂处理组，盐水训练SB334867处理组，吗啡训练溶剂处理组，吗啡训练低剂量SB334867处理组和吗啡训练高剂量SB334867处理组。按照随机分组原则，同时考虑动物个体的自然偏爱基值进行分组，6~10只/组，保证各组的自然偏爱基值之间差异无统计学意义（标准误相差不超过5）。

1.2 药品

盐酸吗啡（青海制药厂，中国）溶于生理盐水，3mg/ml；OXR1选择性拮抗剂SB334867（Tocris公司，英国），溶于二甲基亚砜(DMSO)（Sigma公司，美国）。

1.3核团立体定位插管术

大鼠体重达（280~320） g时行双侧核团插管手术。10％水合氯醛（4 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠。将大鼠头部固定在立体定位仪上，消毒后剪除颅顶部毛皮，暴露颅骨，碘伏消毒颅面，以前囟为原点，根据特定核团的立体定位坐标确定其颅面位置，用麻花钻（φ=1000μm）慢慢钻透颅骨，将不锈钢套管（o.d.=0.6mm，i.d.=0.35 mm）缓缓植入脑内。牙科水泥覆盖创面，以3颗小螺钉固定。防尘针（0.3mm）插入套管，超出套管末端（0.2 ~ 0.3）mm。VTA立体定位坐标为：AP-5.2 mm,ML ±0.9mm,DV-7.7mm（颅骨表面下）（Paxinos and Watson,1997），插管末端位于VTA上方1 mm。NAc立体定位坐标为：AP +1.7mm,ML ±0.8 mm,DV-5.5 mm（颅骨表面下），插管末端位于NAc上方1.5mm。动物术后恢复至少1周进入实验程序。行为实验后，所有大鼠断头取脑，4%多聚甲醛固定后行冰冻切片及Nissl染色，显微镜下观察注射位点。剔除注射位点不准确大鼠的行为数据。

1.4 实验装置

两箱式条件性位置偏爱箱为80 cm×40 cm×40 cm长方体箱，由黑色有机玻璃板围成，顶端开放，内以挡板分隔成2个大小相等但视觉和触觉环境线索不同的箱体。其中一个箱体为光滑底面，侧壁有3 cm宽的红色竖条纹；另一个箱体为栅格底面，四壁无条纹。动物训练时分别在2个箱体内进行，测试时将中间挡板去除。悬于箱体上方的摄像跟踪系统自动记录动物在2个箱体内停留的时间和水平运动距离。

1.5条件性位置偏爱训练程序

条件性位置偏爱（conditioned place preference,CPP）程序分为自然位置偏爱测试（15 min）、条件化训练、训练后偏爱测试（15 min）3个阶段。将2次自然偏爱测试的平均值作为自然偏爱基值，基值测试表明大鼠偏爱栅格底板侧箱体，即侧壁有条纹而底板光滑的箱体为大多数动物的非偏爱侧。因此采用偏倚式CPP程序训练大鼠，即非偏爱侧为伴药侧。动物个体的自然偏爱被考虑进来，因而有少数大鼠（1/10）以栅格底板侧箱体为伴药侧。条件化训练共6d，吗啡训练和盐水训练各3d，交替进行，每天吗啡（morphine）3 mg/kg或生理盐水（saline）皮下注射后大鼠立即放入训练箱中训练45 min。条件化训练结束后第2d进行位置偏爱测试（CPP表达）。所有大鼠均于CPP表达前10~15 min核团内注射SB334867或溶剂二甲基亚砜（DMSO）。注射容量为0.5 μl/侧。

1.6 统计方法

数据以条件化训练前后大鼠在伴药侧箱体停留时间之差（测试值-基值）（偏爱值）显示。组间偏爱值或水平运动距离比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。Post Hoc LSD检验用于组间两两比较。数据以均值±标准误表示。P

2 结 果

2.1 VTA内给予SB334867对吗啡CPP表达的影响

行为实验结束后，根据脑内注射位点鉴定结果剔除注射位点不准确动物的行为数据。最终共35只动物进入统计分析，其中盐水训练溶剂处理组7只，SB334867处理组6只；吗啡训练溶剂处理组9只，低剂量SB334867处理组6只，高剂量SB334867处理组7只。双侧VTA内注射OXR1拮抗剂SB334867对吗啡CPP表达的影响如图1所示。单因素方差分析显示，各组大鼠对伴药侧箱体的偏爱值差异均有统计学意义（F=3.33,P0.05），表明仅给以SB334867对大鼠的自然偏爱无影响。吗啡训练溶剂处理组动物的偏爱值（183.5±30.4）明显高于盐水训练溶剂处理组（P0.05），说明VTA内给以1 μg SB334867未影响吗啡CPP表达，该组动物仍建立了显著的吗啡CPP（P

图2显示双侧VTA内注射SB334867对吗啡CPP表达测试（15 min）中大鼠运动性的影响。如图所示，各组动物在CPP表达时的运动性差异有统计学意义（F=4.42,P

与盐水训练溶剂处理组比较：*P

与盐水训练溶剂处理组比较：×P

2.NAc内给予SB334867对吗啡CPP表达的影响

行为实验结束后，根据脑内注射位点鉴定结果剔除注射位点不准确动物的行为数据。最终共43只动物进入统计分析，其中盐水训练溶剂处理组10只，SB334867处理组8只；吗啡训练溶剂处理组8只，低剂量SB334867处理组8只，高剂量SB334867处理组9只。双侧NAc内注射OXR1拮抗剂SB334867对吗啡CPP表达的影响如图3所示。单因素方差分析显示，各组大鼠对药物匹配侧箱体的偏爱值差异均有统计学意义（F=3.85,P0.05），表明仅给以SB334867不能影响动物的自然偏爱表达。吗啡训练溶剂处理组动物的偏爱值（224±52.1）高于盐水训练溶剂处理组（P0.05），但高于盐水训练溶剂处理组（P

3 讨 论

本研究结果显示：VTA内注射OXR1拮抗剂SB334867抑制吗啡CPP表达，而NAc内给以SB334867不影响吗啡CPP表达。表明orexin通过激活VTA内OXR1促进大鼠觅药行为表达，而NAc内的OXR1不参与觅药行为表达。本结果直接证明，药物相关环境线索诱发的觅药行为需要VTA内的orexin参与，并且通过VTA内OXR1所实现，这进一步扩展了Harris等人的研究［8］。

从本研究结果可见，无论是吗啡训练组还是盐水训练组大鼠的运动性都被VTA内注射SB334867所显著抑制。然而，虽然高、低剂量的SB334867几乎同等程度地显著抑制了大鼠的运动性，但只有前者抑制了吗啡CPP表达，这也表明，吗啡CPP表达被抑制并不是由于SB334867损害了大鼠的运动性，相反，运动减少（如低剂量SB334867）还可能在一定程度上增加了吗啡CPP表达的强度（见图2）。

关于orexin通过VTA参与觅药行为表达的神经机制，目前尚无定论。研究表明，奖赏相关线索引发的奖赏寻求行为伴随着VTA内DA神经元激活［13］，而orexin A可兴奋VTA内DA神经元［11］，增加NAc内DA释放［12］，因此Harris等人认为，orexin A可能是通过兴奋VTA内DA神经元而促进觅药行为表达，如VTA内注射orexin A可使已消退的吗啡CPP恢复表达（CPP reinstatement）［8］。然而，本研究中阻断VTA内OXR1抑制吗啡CPP表达的结果似乎无法完全用上述机制解释。本研究中阻断VTA内OXR1抑制了大鼠的运动性。一般认为自发活动性增加与NAc内DA水平升高有关，那么VTA内注射SB334867则可能是降低了DA神经元活动性，致使NAc内DA水平没有增加，从而抑制了大鼠运动性。因此，尽管SB334867对大鼠运动性的抑制说明其影响了VTA内DA神经元的活动性，但这似乎与其抑制CPP表达无关，因为高、低剂量的SB334867同等程度地抑制了大鼠运动性，但后者并未抑制吗啡CPP表达。而这与其他研究结果相一致，如NAc内给以DA受体拮抗剂不能抑制吗啡CPP的表达［14］。

对于本研究的结果可能存在另一种解释。CPP表达的本质是动物对奖赏相关环境线索（reward-associated environmental cues）的趋近反应，也即一种条件性反应（conditioned response），在一定程度上体现了动物的动机状态，同时也是对奖赏相关线索的记忆提取过程，因而干预动机状态或记忆提取都将影响CPP表达。VTA接受其他脑区的谷氨酸能投射，在这里谷氨酸受体所介导的神经可塑性是药物奖赏与环境线索条件化连接（即奖赏记忆形成）的重要神经基础［15］。有研究表明VTA内谷氨酸受体的激活不仅是吗啡CPP形成而且也是吗啡CPP表达所必需的［16］，即对用药相关环境线索记忆的提取（或觅药动机表达）需要VTA内谷氨酸受体的激活。已有研究表明，orexin A可促进VTA内谷氨酸受体介导的突触可塑性形成［17］，说明orexin A可调制谷氨酸受体的活动性。因而，本实验中阻断VTA内OXR1抑制吗啡CPP表达不能排除是其影响谷氨酸受体活动性的结果。而orexin A在VTA内是否通过调控谷氨酸受体活动而参与觅药行为表达还需要进一步实验的证实。

本研究中NAc 内给以SB334867 未影响吗啡CPP表达，说明orexin A并不通过NAc内OXR1参与觅药行为表达。而且，NAc内给以SB334867也未影响大鼠的自发活动性，这与他人的研究一致，即阻断NAc内OXR1不影响orexin A的运动兴奋效应［18］。然而，本研究只用了OXR1拮抗剂，而NAc内OXR2的密度远高于OXR1［19］，因此本研究的结果并不能排除orexin A可能通过NAc内OXR2参与觅药行为表达，如果有可用的OXR2选择性拮抗剂将能够进一步澄清NAc内OXR2是否在觅药行为表达中发挥作用。

综上所述，orexin A通过激活VTA内OXR1促进药物相关环境线索诱发的大鼠觅药行为表达，而NAc内的OXR1不参与此过程。本研究初步探讨了中脑边缘多巴胺通路的2个核心脑区在食欲素调控觅药行为中的作用，为揭示食欲素参与觅药行为表达的神经机制提供了线索。

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