HPLC—HRMS鉴定抗癌先导物T—OA在鼠尿中的代谢产物
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[摘要] 目的：研究抗癌先导化合物T-OA（齐墩果酰基-3， 5， 6-三甲基吡嗪-2-甲酯）在大鼠尿液中的代谢产物，初步推断其在大鼠体内的代谢方式。方法：收集空白组、原料组（川芎嗪TMP与齐墩果酸OA摩尔等量）及T-OA组大鼠尿液；尿液冷冻干燥，固体经乙酸乙酯超声提取后，提取物用色谱乙腈复溶；hplc-hrms联用技术在ESI+和ESI-模式下寻找可能的质谱峰，通过对比3组谱图的异同得出代谢产物的相关信息。结果：原料组鉴定出1个OA的代谢产物和2个TMP的代谢产物；T-OA组未检测到原料的代谢产物，而得到1个Ⅱ相代谢产物。结论：在大鼠尿液中首次鉴定出1个T-OA的Ⅱ相代谢产物，1个OA的Ⅱ相代谢产物，初步推断T-OA在体内不以原料的形式发挥药效；所建立的HPLC-HRMS方法可用于相关衍生结构的代谢产物鉴定；该文也可为以齐墩果酸为母体的前药设计提供一定的借鉴。
[关键词] 抗癌先导物T-oa；大鼠尿液；代谢产物；HPLC-HRMS
[收稿日期] 2013-11-25
[基金项目] 国家自然科学基金项目（81173519）；北京中医药大学创新团队项目（2011-CXTD-15）
[通信作者] *雷海民，博士，教授，研究方向为中药先导化合物的发现与开发，E-mail：
[作者简介] 绪扩，硕士研究生，E-mail：
中医药理论指导下，以天然活性成分为母体的药物设计与结构修饰研究得到了较多的关注[1-3]。应用生物电子等排原理与拼合原理等现代药学理论及方法寻找选择性强、副作用小、生物利用度高的四甲基吡嗪系列衍生物的研究已有较长时间[4-5]。本课题组前期以经典组方“十全大补丸”中的活性成分为原料设计并合成一系列四甲基吡嗪衍生物[6]。通过体内外药效学评价，初步得到一个具有抗癌活性的先导化合物T-OA（齐墩果酰基-3，5，6-三甲基吡嗪-2-甲酯），见图1，已申报国家发明专利[7]。现有研究资料表明，T-OA具有抑瘤作用的高度选择性、低毒性以及多靶点的特性：对肝癌Bel 7402细胞（IC50= 7.611 mg·L-1）及结肠癌HCT-8细胞（IC50= 9.273 mg·L-1）表现出较强抑制作用；体内对S180肉瘤具有较显著的抑制效果，抑瘤率可达50%；而口服给药的半数致死量超过6.0 g·kg-1[8]。
图1 抗癌先导化合物T-OA的化学结构式
Fig.1 The structure of antitumor lead compound T-OA
本文旨在采用HPLC-HRMS联用技术对抗癌先导物T-OA在大鼠尿液中的代谢产物进行研究，建立相应的质谱检测方法，并通过对比T-OA组与空白组、原料组（TMP/OA摩尔等量）大鼠尿样中化学成分的异同，初步推断先导物在体内的代谢方式。以期进一步完善抗癌先导物T-OA的相关研究，也为今后以齐墩果酸为母体的前药设计提供一定的借鉴。
1 材料
1.1 仪器
HPLC-HRMS联用系统： Thermo Accela 超高效液相色谱仪（Accela 600泵，配备Accela Open自动进样器与四元溶剂控制器）；Thermo LQT Orbitrap XL质谱检测器；Xcalibur工作站；超纯氦气为碰撞气；高纯氮为雾化气。FD-1A-50冷冻干燥机（北京博医实验仪器有限公司）；飞鸽牌TDL-5-A低速大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；金龙鱼大豆油（天津嘉里粮油有限公司；批号2013/03/02）；T-OA对照品（实验室自制；批号20120901）；川芎嗪与齐墩果酸（上海迈瑞尔化学技术有限公司）。
1.2 动物
健康SD大鼠15只（随机分为3组），雄性，体重（180±5） g，普通级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证SCXK（京）2012-0001。
2 方法
2.1 色谱-质谱条件
HPLC检测条件：Agilent ZORBAX？SB-Aq色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相由水（A）-乙腈（B）组成；采用线性梯度洗脱，0～60 min，5%～95% B；紫外波长208 nm；柱温30 ℃；进样体积10 μL；柱后按4∶1分流，进质谱检测器。
质谱检测条件：ESI离子源，扫描方式ESI+和ESI-模式，毛细管电压为+4 kV和-3 kV；锥孔电压±110 V；离子源温度300 ℃；毛细管温度350 ℃；碰撞气为氦气，碰撞能35 V；鞘气流量35 L·min-1；辅助气流量10 L·min-1；质量扫描范围m/z 100～1 200。
2.2 生物样本的制备
2.2.1 灌胃药液 由于T-OA的水溶性较差[9]，故以食用油为灌胃液。称取T-OA 270 mg，乙酸乙酯溶解后，3.6 mL大豆油分散，油泵抽至无乙酸乙酯味，制成75 g·L-1的大豆油溶液；另取川芎嗪62 mg与齐墩果酸208 mg，同法制成混合油溶液，均临用前配制。
2.2.2 尿样收集 将大鼠分别置于清洁的代谢笼中，禁食12 h（自由饮水），T-OA组大鼠灌胃0.72 mL的T-OA大豆油溶液，原料组大鼠灌胃等量的OA与TMP大豆油溶液，空白组大鼠灌胃等量的大豆油，收集0～24 h的尿液。尿液5 000 r·min-1离心15 min，上清液转移至150 mL圆底烧瓶（10 mL/瓶），置于-20 ℃冰箱中冷冻保存，备用。
2.2.3 尿样处理 取结块的尿样，冷冻干燥12 h，固体加乙酸乙酯50 mL超声提取1 h，5 000 r·min-1离心10 min，上清液37 ℃蒸干；固体以10 mL乙腈超声溶解，过0.22 μm滤膜，备用。
3 结果
3.1 空白组尿样的HPLC-HRMS分析
取大鼠空白尿样10 mL，按照2.2项下制备空白组供试溶液；取10 μL注入HPLC-HRMS联用仪。参照化合物代谢的常见途径、合成原料TMP与OA的代谢特点，见表1[10-14]，在Xcalibur工作窗口提取准确的相关离子峰，作为原料组及T-OA组谱图分析的空白对照。
表1 T-OA与TMP，OA的可能代谢方式、分子式变化及质量变化
Table 1 The expected metabolites of T-OA， TMP and OA in rats′ urine
3.2 原料组及T-OA组尿样的HPLC-HRMS分析
分别取原料组及T-OA组大鼠的尿样10 mL，按照2.2项下同法制备原料组及T-OA组尿液供试溶液；取10 μL注入HPLC-HRMS联用仪，参照表1提取并筛选可能的离子峰，通过与空白组尿样对比，最终在原料组尿样中得到离子峰A，B，C，在T-OA组尿样中得到离子峰D。各离子峰的保留时间、准确分子质量、元素组成等信息见表2。
在原料组尿样中提取165.06的相对分子质量，通过比较3组谱图，ESI-模式扫描得到离子峰A，精确分子量m/z 165.066 76，分子式C8H9O2N2；ESI+模式提取153.10与781.47的相对分子质量，得到离子峰B（相对分子质量m/z 153.102 10；分子式C8H13ON2）及离子峰C（相对分子质量m/z 781.473 21；分子式C42H69O13）。误差范围内，离子峰A的结构确定为2-羧基-3， 5， 6-三甲基吡嗪（TMP-COOH），峰B的结构确定为2-羟甲基-3， 5， 6-三甲基吡嗪（TMP-OH）。TMP-OH为川芎嗪在人、兔及大鼠尿液的主要代谢产物[11-13]；通过对比空白
表2 大鼠尿液中主要代谢产物的保留时间、准确分子质量、元素组成及精确度
Table 2 Retention time， accurate mass， elementary composition and precision of metabolites
组尿样质谱图，原料组尿样中m/z 165.066 76峰证实TMP-COOH同样为川芎嗪在大鼠尿液中的代谢产物。近年，齐墩果酸的体内代谢产物研究较少，文献曾报道其代谢方式主要为母体结构的羟基化[14]。本实验中，原料组在ESI+模式下得到m/z 781.473 21峰，初步证实OA在体内的代谢方式为加2分子葡萄糖基，但未找到羟基化产物。峰A-C的信息见图2（顺序依次为空白组、原料组及T-OA组）。
A. 空白组；B.原料组；C.T-OA组（图3同）。
图2 原料组大鼠尿样中质谱峰A～C的离子流图、精确相对分子质量及其结构解析
Fig.2 Ion current chromatogram， accurate mass and structure of peaks A-C in material group urine
在T-OA组的大鼠尿样中，未发现合成原料TMP与OA代谢产物的相关离子峰。参照表1及合成原料的常见代谢方式，提取775.48的相对分子质量，通过比较3组谱图，ESI+模式扫描得到离子峰D，精确相对分子质量m/z 775.483 83，分子式C44H68O8N2Na；对比空白组及原料组尿样谱图，在误差范围内，峰D确定为T-OA与1分子葡萄糖结合的[M+Na]+峰（精确度为-1.431），但离子流强度较低（5.34×103）。峰D的离子流图见图3。
图3 T-OA组大鼠尿样中质谱峰D的离子流图、精确相对分子质量及其结构解析
Fig.3 Ion current chromatogram， accurate mass and structure of peak D in T-OA group urine
4 结论与展望
本实验在原料组大鼠尿液中鉴定出1个齐墩果酸的代谢产物与2个川芎嗪的代谢产物；齐墩果酸加两分子葡萄糖基的尿液代谢产物为首次鉴定得到；TMP-OH为鼠尿中的主要代谢产物[11]，原料组尿样中m/z 165.066 76峰证实TMP-COOH也为川芎嗪在鼠尿中的代谢产物。在T-OA组大鼠尿液未检测到合成原料的代谢产物，得到加1分子葡萄糖基的Ⅱ相代谢产物。抗癌先导物T-OA为齐墩果酸与川芎嗪分子片段以酯键形式相连的化学实体，初步推断其在大鼠体内不以原料片段的形式发挥药效；本实验丰富了其临床前的相关研究。
近年，有关五环三萜类化合物体内代谢的文献报道较少，本文所建立的HPLC-HRMS方法可用于相关衍生化合物的代谢产物分析，也可为以齐墩果酸为母体的前药设计提供借鉴。
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Identification of metabolites of antitumor lead compound
T-OA in rat urine by HPLC-HRMS
XU Kuo， GONG Yan， XU Bing， TIAN Yu-fei， WANG Ming-xi， ZHANG Hua-zheng， ZHANG Yu-zhong， LEI Hai-min
（1. School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；
2. School of Basic Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）
[Abstract] Objective： To study the major metabolites of antitumor lead compound T-OA （oleanolic acyl-3， 5， 6-trimethyl pyrazine-2-methyl ester） in rat urine， in order to preliminarily infer its metabolic mode in rats. Method： Rat urines of the blank group， the raw material group （ligustrazine TMP and oleanolic acid OA Moore equivalent） and the T-OA group were collected and freeze-dried； Solids were extracted by ethyl acetate； And then the extracts were re-dissolved with acetonitrile. HPLC-HRMS coupling technique was adopted to find the potential mass spectrum peak under ESI+和ESI-modes. Metabolite-related information was obtained by comparing the three groups of spectra. Result： One metabolite of OA and two metabolites of TMP were identified in the raw material group； none metabolite of T-OA but one phase Ⅱ metabolite was detected in the T-OA group. Conclusion： It is the first time to identify one phase Ⅱ metabolite of T-OA and one phase Ⅱ metabolite of OA were identified in rat urine. On that basis， the researchers preliminarily inferred that T-OA does not show the efficacy in the form of raw material. The HPLC-HRMS method established could be used to identify metabolites of related derivative structures. This paper could also provide certain reference for designing pro-drugs based on oleanolic acid.
[Key words] antitumor lead compound T-OA； rat urine； metabolite； HPLC-HRMS
doi：10.4268/cjcmm20140530