脑微透析与自动采血技术联用研究丹参素的药动学特性
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[摘要] 通过微透析法联合自动采血技术研究丹参素在大鼠体内的药动学特性。微透析探针植入大鼠侧脑室，连续收集静脉注射丹参素后的透析液样品及血液样品，采用LC-MS/MS测定丹参素浓度，经回收率校正后，用WinNonlin药动学软件计算主要药动学参数。静脉注射丹参素后，丹参素在血液中、脑内的Ke分别为0、04，0、018 min-1，t1/2为16、64，58、76 min，AUC0-t为812、59，51、19 min・mg・L-1，MRT为15、28，79、97 min。建立的LC-MS/MS方法简便、高效、无干扰，可进行丹参素生物样品的检测；微透析技术与自动采血技术联用，较好的反映了丹参素在血液及大脑中的动力学特征，为药物药动学研究提供一个新视角。
[关键词] 丹参素；脑微透析；自动采血；药动学；LC-MS/MS
[收稿日期] 2013-04-03
[基金项目] 国家自然科学基金项目（81102879，81273654）；国家“重大新药创制”科技重大专项（2013ZX09103002-022）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（20101106120049）；国家科技支撑计划项目（2008BAI51BOO）
[通信作者] *杨志宏，副研究员，主要从事药物代谢动力学及中药复方配伍机制研究，Tel：（010）57833219，E-mail：zhyang@implad、ac、cn；*孙晓波，研究员，博士生导师，从事中药药效物质基础与作用机制研究、创新药物开发研究，Tel：（010）57833013，E-mail：sxbimplad@gmail、com
[作者简介] 吉恋英，硕士研究生， Tel：18911037107，E-mail：jilianying101@gmail、com 丹参Salvia miltiorrhiza Bunge为唇形科鼠尾草属植物丹参的干燥根及根茎，现代研究表明丹参具有扩张冠脉、增加冠脉血流量、改善脑缺血再灌注损伤、防止心肌缺血和心肌梗死、改善微循环等作用[1-4]，临床上用于治疗中风、冠心病、高血脂症等。丹参素（Danshensu，DSS）是丹参主要的水溶性活性成分之一 [5-6]。丹参素在大鼠血浆、脑内的药动学行为研究已有报道[7-8]，而同时研究血浆、脑内的丹参素药动学特性的较少。以往脑内药代动力学的研究主要采用全脑匀浆测定法研究药物脑内动力学行为，该法存在实验动物需要量大、实验次数多、样品处理过程复杂、样品检测干扰多等局限性。微透析技术（microdialysis，MD）是近年来兴起的一种在线监测活体采样技术，具有实时、高效、在线、活体的优势[9-10]，在药动学研究[11]、药物转运[12]、药物靶向分布[13]等领域中应用广泛。本研究采用微透析法联合自动采血技术通过LC-MS/MS分析方法测定大鼠静脉给予丹参素后不同时间点的血药浓度，进而研究丹参素在大鼠体内的药动学特征。
1 材料
1、1 药品与试剂 丹参素钠对照品（中国食品药品检定研究院，批号110855-200809，纯度>99%）；对羟基苯甲酸为内标（国药集团化学试剂有限公司，批号T20070815， 纯度>99%）。乙腈、甲酸（德国Merck公司）、甲醇（美国Fisher Scientific公司）、乙酸乙酯（美国Honeywell公司），均为色谱纯，实验用水为超纯水（电导率为18、2 MΩ・cm2），其他化学试剂均为分析纯。人工脑脊液（aCSF）：NaCl 147 mmol・L-1，KCl 2、7 mmol・L-1，CaCl2 1、2 mmol・L-1，MgCl2 0、85 mmol・L-1， pH 7、2～7、4。
1、2 动物 健康雄性SD大鼠，SPF级，体重280～300 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号 SCXK（京）2012-0001。
1、3 仪器 Agilent 1200液相色谱仪（美国Agilent公司）；3200QTrap串联四级杆线性离子阱质谱仪（美国AB SCIEX公司），Turbo Ionspray离子源，Analyst 1、4、2数据处理系统； Milli-Q Gradient A10超纯水器（美国Millipore公司）；脑立体定位仪（美国Stoeling公司）；微透析系统（瑞典CMA公司）；MAB6、14、4（瑞典MAB公司）；ABS2自动采血仪（美国Instech Laboratories）。
2 方法和结果
2、1 测定条件 色谱条件：Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱 （2、1 mm×50 mm，3、5 μm），流动相A为0、03%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱方式0～0、2 min，5%～90% B；0、2～3、0 min，90% B，进样量为20 μL。
质谱条件为电喷雾离子化（ESI）；检测方式负离子检测；扫描方式多反应监测（MRM）；离子喷射电压-4 500 V，温度450 ℃；用于定量分析的离子反应分别为丹参素m/z 197、2/135、1，内标对羟基苯甲酸m/z 137、0/ 93、0。
2、2 溶液的配制 精密称取丹参素钠对照品1 mg，用甲醇定容至1 mL，配制成1 g・L-1溶液作为对照品贮备液（于4 ℃下避光保存）。使用aCSF进行倍比稀释的质量浓度分别是3、20，1、60，0、80，0、40，0、20，0、10，0、05，0、025，0、012 5 mg・L-1的丹参素钠标准溶液；精密量取适量的丹参素贮备液，用甲醇稀释成300，200，100，50，25，12、5， 6、25，3、13，1、56，0、78，0、39，0、195，0、 10 mg・L-1的标准溶液。
2、3 样品处理 血样：取空白血浆100 μL于洁净玻璃管中，精密加入0、5 mg・L-1内标10 μL，然后加入10% HCl 100 μL，涡旋混匀，加入4 mL的乙酸乙酯振荡提取5 min，离心并移取全部上清、真空旋蒸，0、03 %甲酸和乙腈混合液100 μL复溶，涡旋振荡5 min，13 000 r・min-1离心10 min，吸取上清进样，样品与内标峰面积比进行定量分析。
脑微透析液：收集的微透析样品20 μL，或精密取aCSF稀释的标准溶液20 μL，加入0、05 mg・L-1内标40 μL。
2、4 标准曲线及最低定量限 用权重（ω=1/x2）最小二乘法进行回归运算，得回归方程及相关系数：Y= 0、258C-0、005，R2=0、995（aCSF）；Y = 0、419C + 0、006，R2 = 0、999（血浆），丹参素在所检测的范围内线性良好。aCSF中丹参素的LLOQ为0、025 mg・L-1，血浆中丹参素的LLOQ为0、01 mg・L-1。
2、5 专属性 血浆中及aCSF中的丹参素色谱图形良好，内源性物质对丹参素及内标的测定无干扰，见图1，2。丹参素及内标的保留时间分别为1、27，2、86 min。
图1 丹参素（A）和内标（B）质谱图
Fig、1 The mass spectrum of Danshensu （A） and IS （B）
A、空白aCSF、空白血浆；B、空白aCSF、空白血浆中分别加入0、025，0、01 mg・L-1丹参素及0、05，0、5 mg・L-1内标；C、给药30 min后脑内及血浆中的丹参素。
图2 丹参素与内标MRM图
Fig、2 The MRM chromatograms of DSS and IS
2、6 精密度、准确度考察 方法见2、2项，使100 μL空白血浆中丹参素的质量浓度为20、0，2、50，0、31，0、02 mg・L-1；aCSF中丹参素的高中低质量浓度分别为1、60，0、40，0、05 mg・L-1，考察批内变异和批间变异情况。精密度、准确度分别使用RSD，RE来表示，见表1。
2、7 稳定性 血样：100 μL空白血浆精密加入不同量的对照品，使丹参素的质量浓度为2、50，0、31，0、02 mg・L-1，置-80 ℃冰箱保存7 d，用37 ℃恒温水浴解冻后，测定药物浓度。结果显示，各浓度丹参素的峰面积RSD分别为5、0%，5、0%，19%，说明血浆中的丹参素在-80 ℃放置内较稳定。
微透析样品：取高中低质量浓度分别为1、60，0、40，0、05 mg・L-1的丹参素标准溶液，每个浓度5个样品，置自动进样器（4 ℃）于12 h内进样，测定
峰面积值。结果显示，低中高浓度的峰面积RSD分别为5、3%，5、1%，8、7%，表明aCSF中的丹参素在12 h内较稳定。
2、8 提取回收率 100 μL空白血浆精密加入不同量的标准品，使丹参素的质量浓度为20、0，2、50，0、31，0、02 mg・L-1，按2、2项下处理样品，测得血浆中丹参素的提取回收率分别为94、53%，83、3%，82、03%，100、7%，这说明该提取方法的效果较佳。
2、9 基质效应 血样：空白血浆和超纯水各100 μL，按照2、2项下处理样品，不加内标，挥干后加入标准工作液，挥干复溶，使丹参素的终质量浓度为20、0，0、63，0、02 mg・L-1，分别记录峰面积为A1，A2。内标（0、50 mg・L-1）同时进行考察，见表2。血浆中的丹参素基本无基质效应。
微透析样品：分别使用空白aCSF、纯水稀释丹参素溶液，使丹参素的质量浓度分别为1、60，0、40，0、05 mg・L-1，数据结果显示，aCSF中的丹参素存在基质效应，基质效应因子（matrix factor，MF）皆为60%左右，说明基质效应对所测定的丹参素浓度范围内的影响较一致，数据比较稳定；且目前情况下可以满足实验检测灵敏度的需要，所以当前方法是可实际应用于本项研究的。
2、10 探针回收率 探针平衡1、5 h后，空白aCSF换成含0、8 mg・L-1丹参素的aCSF，采样时间为10 min，连续收集4份样品。按以下公式[14]进行计算：Rdial = （Cperf・Cdial）/Cperf。式中Cperf为灌流中的药物浓度，Cdial为透析液中的浓度。根据上述公式，本实验的探针平均回收率为19、27%。
3 药代动力学研究
取SD雄性大鼠（n=4），20%乌拉坦腹腔注射麻醉（1、2 g・kg-1），仰位固定于鼠板，去毛后在颈部偏右侧位置切口，钝性分离颈静脉，颈静脉埋管取血。打开ABS采血仪及其软件，使用10 U肝素钠溶液灌流采血仪的整个管路，设置采血时间点（5，15，30，60，90，120，180，240，300 min），采血量为250 μL/时间点。将动物与仪器连接，待给药后，立即启动自动采血。
继上述手术后，转移至脑立体定位仪，固定大鼠头部。颅顶皮肤消毒、被皮，划开头盖骨皮肤，暴露颅骨，按照大鼠脑立体定位图谱[15]，以前囟为定位基点，于左侧大脑侧脑室位置（AP：-0、8 mm，ML：-1、6 mm）定位后，钻孔、缓慢小心地植入探针（DV：-6、0 mm）。以空白aCSF 2、0 μL・min-1的流速灌流，探针平衡1、5 h之后股静脉注射丹参素（50 mg・kg-1，2 mL・mL-1），样品收集时间为10 min，持续收集4 h。实验结束后，脊椎脱臼处死大鼠，断头取脑，切片观察探针取样位置，若发现探针错位则实验结果不计。
测定脑内、血浆中丹参素浓度，绘制药时曲线，见图3，4。运用WinNonlin软件（版本 6、1，美国Pharsight Corporation）以非房室模型计算其主要的代谢动力学参数，见表3。
4 讨论
4、1 分析条件的优化 本研究选择乙腈、0、03%甲酸为流动相，使用MRM扫描方式，丹参素具有较好的峰形及质谱行为；采用梯度洗脱方式，使分析周期减至7、5 min。选择aCSF作为微透析灌流液，其中含较高量的无机盐离子，这些离子会影响丹参素在LC-MS中的离子化，即产生基质效应。通过0、03%甲酸溶液稀释后（1∶2），丹参素在aCSF中的MF由40%变为60%以上，说明0、03%甲酸稀释可降低其
图3 血中丹参素药时曲线（n=4）
Fig、3 Concentration-time curves in blood after iv administration of Danshensu （n=4）
图4 脑内丹参素药时曲线（n=4）
Fig、4 Concentration-time curves in brain after iv administration of Danshensu （n=4）
基质效应。进行血样提取时，发现未加10% HCl时，血浆中的丹参素很难被萃取出来；而添加100 μL 10% HCl经乙酸乙酯进行萃取后，能使血浆中的丹参素有较高的提取回收率（80%以上）。
4、2 丹参素在大鼠体内的动力学研究 脑内药物药动学研究，通常采用全脑匀浆法，但是脑内含大量的杂质，对检测结果干扰很大。MD技术具有样品无需前处理，可直接进样分析[8]；可连续采样，所需的实验动物少；采样体积少，不影响实验动物的正常生理状态等优势。MD获得的是药物游离浓度，游离药物浓度与药效成正比，更具有临床意义。通常以眼内眦、剪尾、颈静脉插管等方式[16]进行血液采样。与前述方法相比较而言，自动采血技术可减少动物应激反应；可在动物清醒状态进行采样；在采血的同时补充适量的生理盐水（而样品不被稀释），保证实验动物的正常生理状态；准确记录采血时间，精确控制采血量；可减少或避免血样中混入组织液。ABS可与MD联用[17]，实现血液与脑组织同时采样，可更全面的了解药物在体内的药动学特性。
静脉注射后，丹参素迅速入血，并通过BBB进入侧脑室，血浆中、脑内的丹参素消除速率常数分别为0、04，0、018 min-1，前者约为后者的2倍，说明血浆中的丹参素比脑内的丹参素消除速度快。丹参素在血液中的t1/2为16、64 min，结果与前人报道基本一致[18]，说明丹参素迅速向各组织分布[19]，同时也表明了自动采血技术可很好地反映丹参素在血浆中的动力学行为。丹参素是丹参酚酸类成分之一，较易透过BBB[20]，在脑内的t1/2为58、76 min。丹参素体内的药代参数数据为丹参素的药动学行为特征、药物靶向器官变化、药物作用物质基础、PK-PD研究、配伍机制研究提供实验依据。
本实验建立了大鼠体内丹参素MD-ABS-LC-MS/MS研究方法，该法简便、稳定，为丹参素在血液中、脑内的药动学研究提供实验数据；同时为微透析技术与自动采血技术联用研究药物在血液与脑内的药动学行为提供可借鉴的方法。
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Pharmacokinetics study on Danshensu in rats by brain
microdialysis and automated blood technique
JI Lian-ying1， YANG Zhi-hong1*， HOU Cong-song1， 2， SUN Xiao-bo1*
（1、Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and
Peking Union Medical College， Beijing 100193， China；
2、 Hebei North University， Zhangjiakou 075000， China）
[Abstract] To research the pharmacokinetic of Danshensu in brain via microdialysis method and automated blood technique、 A microdialysis probe was inserted into the left lateral ventricle， and then dialysate samples and blood samples were continuously collected after iv Danshensu、 LC-MS/MS was used to determinate for Danshensu in the dialysate samples、 The in vivo recovery was used for the calibration of probe、 WinNonlin was used for analyzing all pharmacokinetic data、 Pharmacokinetic parameters of DSS in blood and in brain showed that Ke， t1/2， AUC0-t， MRT were 0、04， 0、018 min-1， 16、64， 58、76 min， 812、59， 51、19 min・mg・L-1， 15、28，79、97 min， respectively、 The results were indicated that the study was successfully established LC-MS/MS detection method for Danshensu、 Microdialysis combined with automated blood technique could better reflect the dynamic characteristics of Danshensu in the rat brain， and it provides a new perspective for pharmacokinetic study、
[Key words] danshensu； pharmacokinetics； microdialysis； automated blood； LC-MS/MS
doi：10.4268/cjcmm20132130