川芎嗪对大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响

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【摘要】 目的 探讨川芎嗪对大鼠心肌缺血再灌注损伤时细胞凋亡的影响及可能的机制。方法 雄性SD大鼠36只随机分三组：假手术组、模型组、川芎嗪治疗组，每组12只。用结扎大鼠左冠状动脉前降支法制备心肌缺血再灌注模型，测定再灌注前静脉注入川芎嗪对损伤大鼠心肌组织中MDA,SOD生成的影响；免疫组化法检测大鼠心肌细胞Bcl-2、Bax基因表达。结果 ①川芎嗪组能减少心肌组织中MDA生成，并明显提高缺血再灌注组织中SOD的活力； ②川芎嗪组中bcl-2表达明显增多，平均灰度值明显下降，与模型组比较有显著差异（P>0.01），bax表达下降，但无统计学意义（P>0.05）。结论 川芎嗪可能通过拮抗氧自由基、上调凋亡抑制基因bcl-2等作用，对心肌缺血再灌注损伤时细胞凋亡有一定的防治作用。

【关键词】 川芎嗪；缺血再灌注损伤；自由基；心肌细胞凋亡

Protective effects of chuan xiong qin against ischemia/reperfusion injury in rats

LIU Jing,NIU Peng-wu.

Department of cardiology,the nineth people’s hospital of shenyang,Shenyang 110024,China

【Abstract】 Objective The objective of the present study is to investigate the Effects and mechanism of chuan xiong qin on cardiomyocyte apoptosis after ischemia reperfusion.Methods 36maleSprague- Dauleyrats were randomly divided into Three groups:sham operating group, ischemia reperfusion group, treatmentgroup，which group had 12 rats. Theleftanterior descended(LAD)coronary arterywas ligated to establish the ischemia／reperfusion heart model. Theratswere injected chuan xiong qinbeforereperfusion. Theconcentrations ofSOD，MDA inmyocardial were measured;The expression of Bax andBcl-2 genes were investigated by immunohistochemistry.Results ①chuan xiong qin decreased the MDA contents, improved the SOD activities;②chuan xiong qin donot inhibit the expression of bax gene but significantlyincreased expression of Bcl-2 gene.ConclusionThe results indicate that chuan xiong qin can inhibit apoptosis induced by ischemia-reperfasion injury throughresisting thedamagingof free adical and increasing the expression of Bcl-2 gene.

【Key words】 Chuan xiong qin; Ischemia-reperfusion injury; Free adical; Apoptosis

近年来，研究发现细胞凋亡(apoptosis)是急性心肌缺血再灌注过程中心肌细胞死亡的重要机制之一， 因此深入研究急性心肌缺血再灌注时心肌细胞的凋亡及其防治有着十分重要的意义［1］。细胞凋亡的发生、发展可能与自由基损伤、中性粒细胞聚集、钙稳态失衡及内皮功能紊乱等有关，并且受多种基因调控，川芎嗪具有多种心血管保护作用，近年被广泛应用于心脑血管疾病，但其在心肌缺血再灌注损伤时心肌细胞凋亡中的作用则少见报道，现对此做一初步研究。

1 材料和方法

1．1 实验动物 健康雄性SD大鼠36只,体重222~242 g左右。购自中国医科大学实验动物中心。随机分为三组：假手术组、模型组及川芎嗪治疗组，每组12只。

1．2 主要仪器及试剂 病理图象分析仪（同济影响公司HJP-1000）；川芎嗪注射液由安徽省立药业有限公司新特药分公司生产（每支2 ml，相当于原生药40 mg）；免疫组化染色试剂盒（购自武汉博士得生物工程有限公司）。

1．3 心肌缺血再灌注损伤模型的建立 各组动物术前禁食24 h，20%乌拉坦（1 g/kg）腹腔麻醉，气管插管，连呼吸机，机械通气；描记肢导心电图；胸骨左缘2 mm处开胸，剪开心包，暴露冠脉，在左前降支起点后0.5 cm穿一丝线，垫一硅胶管，血压稳定时结扎，关闭胸腔。45 min后经尾静脉注入治疗药物及溶液，川芎嗪治疗组按50 mg/kg（按人和动物体重比例计算，为临床剂量的5倍）的剂量给药，用生理盐水稀释到2.0 ml，再灌注前静脉注入，其余两组以等量生理盐水注入。之后打开胸腔，剪去结扎线，假手术组置线后不予结扎，冠脉断流及再通与否依心电图ST段抬高及恢复为准。再灌注1 h后，取部分左室心肌立即放入中尔马林溶液中固定12~20 h后送病理室，制成蜡块标本，连续切片，其中5张严格按免疫组化方法进行染色，DAB显色，光镜下观察bcl-2、bax的表达情况； 再取部分左室标本放入储存管中，移入-70℃冰箱中留做SOD、MDA的检测。

1．4检测指标

1．4．1 心肌组织中SOD、MDA含量的测定

制作心肌组织匀浆，将10%的匀浆用低温低速离心机3000 r/min左右离心10 min，留上清，然后按试剂盒要求测定SOD、MDA含量。

1．4．2 bcl-2、bax的表达 用免疫组化方法分析，切片厚4 μm，常规脱蜡水化，一抗为兔抗大鼠Bax或Bcl-2单克隆抗体(1：50稀释)，二抗为生物素化羊抗兔IgG(1：100稀释)，以PBS代替一抗作阴性对照，DAB显色，光镜观察阳性信号。胞质染成棕黄色的为阳性细胞。病理图文彩色分析仪进行半定量分析，高倍镜下（×400）下每组选取10个视野，对视野内免疫组化阳性信号进行图象分析计算平均灰度值，以相应的均值分别代表每张标本染色的深浅，最后以每组均值进行比较。平均灰度值与bcl-2、bax的阳性表达程度成反变关系。

1．5 实验数据计算及统计学分析 采用SPSS 12.0统计软件，所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析与q检验,以P

2 结果

2.1 心肌组织中SOD、MDA含量的测定

如表1所示，模型组MDA含量明显高于假手术组，SOD的活力显著降低，与假手术组比较有显著差异(P>0.01)。与模型组比较，川芎嗪治疗组能减少心肌中MDA的生成，有统计学意义（P>0.05）；能明显提高再灌注组织中SOD的活力，差异非常显著(P>0.01)。

2.2 各组大鼠心肌组织bax和bcl-2基因蛋白表达及图像分析

免疫组化结果显示， 假手术组中bcl-2和bax均有轻度表达；模型组中bcl-2表达减少，其平均灰度值增加，与假手术组比较，差异有显著性（P0.01)川芎嗪组中bcl-2表达明显增多，其平均灰度值明显下降，与模型组比较，差异非常显著(P>0.01)，bax表达下降，其平均灰度值增加，但无显著性差异（P>0.05）。见表2。

3 讨论

近年来的研究表明，心肌缺血再灌注损伤的一个重要表现是心肌细胞的凋亡［2］。心肌缺血再灌注损伤过程中产生大量氧自由基，自由基可能通过以下途径诱发细胞发生凋亡:①作用于细胞膜，引起膜发生脂质过氧化，从而影响细胞信号转导系统；②直接损伤DNA，诱发细胞凋亡；③影响核基因转导，改变细胞的表型特征，诱发细胞凋亡；④攻击蛋白质，使具有酶活性的蛋白质活性丧失或减弱。川芎嗪是从中药川芎的生物碱中分离得到有效单体，有改善微循环，扩冠脉，抗血小板聚集及抗血栓等多种作用，近年被广泛的应用于心脑血管疾病的治疗，尤其在心肌缺血再灌注损伤方面，已取得肯定疗效。实验证明［3］，川芎嗪能减轻氧自由基损伤，使抗氧化作用增强。本实验结果显示，大鼠心肌缺血再灌注后，心肌中的SOD活性降低，MDA大量生成同时心肌细胞发生凋亡。川芎嗪治疗组可以明显提高心肌组织中SOD的活力，降低MDA的生成量，从而表现出减轻缺血再灌注导致的损伤乃至心肌细胞的凋亡。其机制可能是通过激活抗氧化酶，提高SOD活性，清除H2O2和OH.-的前身O.-2,减少过多氧自由基对组织的损伤，终止链式的脂质过氧化反应，保护细胞结构和功能的完整性，从而减少细胞凋亡的发生。

细胞凋亡的基因调控包括促进细胞凋亡和抑制细胞凋亡两个方面［4］。Bcl-2是目前已知抑制凋亡最重要的一种基因，bax则是细胞凋亡的促进基因。BCI-2/Bax的比例被认为是确定细胞是存活还是死亡的关键因素［5］。研究发现，bcl-2家族蛋白质的活性由其磷酸化状态及其与其他家族成员形成同型或异形二聚体的能力所控制，一方面，bcl-2与bax结合形成异形二聚体而使bax失活；另一方面，如bcl-2被磷酸化或Bad与bcl-2相结合，Bax就从该二聚体中释放出来，游离的bax，然后可以形成诱导细胞死亡的同型二聚体，启动Caspase酶系级联反应，从而导致细胞凋亡。本实验结果表明bcl-2阳性表达上调可抑制心肌细胞的过度凋亡。Bax的作用与bcl-2相反，对细胞凋亡有促进作用。本实验结果进一步表明川芎嗪可明显增加bcl-2的表达，对Bax的表达未见明显影响，说明川芎嗪可能通过上调凋亡抑制基因bcl-2的表达，增加bcl-2/Bax的比例，从而减轻心肌缺血再灌注损伤诱发的细胞凋亡。

综上所述，川芎嗪可有效的防治心肌缺血再灌注损伤诱发的细胞凋亡，其机制可能通过拮抗自由基、促进凋亡抑制基因的蛋白表达等。由于川芎嗪无明显不良反应，货源充足，价格便宜，故具有广泛的临床应用前景。

参考文献

［1］ Shirio k, Otanih, yamamotoF, et al Mk2-1-gene knockout mouse hearts carry anti-apoptotic signal and are resistant to ischern ia reperfusion injury. Jmol cell cardiol, 2005,38(1):93-97.

［2］ Mccully JD,Wakiyama H, Hsieh YJ,et al. Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. AM J Physiol Heart Circ physiol,2004,286(5):1923-1935.

［3］ 顾迎春，于晓玲，郭维军，等. 川芎嗪后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用.国际心血管病杂志，2009,36（5）：304-307.

［4］ 刘善浩，汪兴洪,等.细胞凋亡抑制蛋白-2研究进展.安徽医药,2009，13（1）：11-12.

［5］ Zhao ZQ,et al.Cardiovas Res,2000，45：651.