三叶青愈伤组织诱导及分化培养基筛选

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摘要 以三叶青不带腋芽的茎段为外植体，采用正交试验的方法研究了不同培养基和激素水平对三叶青愈伤组织诱导及不定芽分化的影响。结果表明，以培养基MS+6-BA 2 mg/L+IBA 0.2 mg/L最有利于愈伤组织的诱导，20 d后诱导率为96.7%；以培养基B5+6-BA 2 mg/L+NAA 1.0 mg/L最有利于不定芽的分化，40 d后分化率为66.7%。

关键词 三叶青；愈伤组织；诱导；分化；培养基；筛选

中图分类号 S567.23+9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）21-0121-02

Selection of Medium for Differentiation and Callus Induction of Tetrastigma Hemsleyanum

WU Hao PENG Xin * LIN Yan-na JIN Wen-tao

（Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo Zhejiang 315100）

Abstract The orthogonal experiment was designed to study the impact of different medium，hormone combination on differentiation and callus induction from stem without auxiliary bud of Tetrastigma hemsleyanum.The results showed that the optimal callus induction medium was MS+6-BA 2 mg/L +IBA 0.2 mg/L，the callus induction rate was 96.7% after 20 days；The optimal differentiation medium was B5+6-BA 2 mg/L+NAA 1.0 mg/L，the bud differentiation rate was 66.7% after 40 days.

Key words Tetrastigma hemsleyanum；callus；induction；differentiation；medium；selection

三叶青（Tetrastigma hemsleyanum）又名金钱吊葫芦，是葡萄科多年生蔓生藤本植物，以块根或全草入药，是我国独有的珍贵物种。其主要活性成分黄酮可用于治疗高热、扁桃体炎、肝炎、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病，也是抗肿瘤常用药物[1-2]。三叶青对生长环境的要求非常苛刻，近年来，随着自然环境恶化以及人们无序的采挖，致使野生三叶青资源已濒临灭绝。

目前，对三叶青的研究主要集中在其药理作用上，而关于三叶青的组织培养研究尚少见报道[3-4]，且都是以带腋芽的茎段为外植体，繁殖系数较低。另外，培养基的组分都是以单因素水平来设计的，无法准确了解多因素的相互作用。本研究以不带腋芽的茎段为外植体，选择不同的培养基和激素配比进行正交试验，以筛选出愈伤组织诱导和芽分化的较佳培养基，从而为三叶青的快速繁殖提供新途径。1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料采自浙江省丽水市，经安徽师范大学生命科学学院周守标教授鉴定为三叶青，外植体取不带腋芽的幼嫩茎段。

1.2 试验设计

愈伤组织诱导采用正交试验设计，设3个因素，每个因素3个水平，共9个处理，即培养基（White、B5、MS）、6-BA（1、2、4 mg/L）、IBA（0、0.2、0.5 mg/L）。愈伤组织分化试验也采用正交试验设计，设3个因素，每个因素3个水平。共9个处理，即培养基（White、B5、MS）、6-BA（2、3、4 mg/L）、NAA（0.5、1.0、2.0 mg/L）。

1.3 试验方法

取新鲜采集的幼嫩茎段，用自来水冲洗2 h，然后在无菌超净台上用8% NaClO消毒5 min后，无菌去离子水清洗6次，再用0.1% HgCl2消毒5 min，取出，用无菌去离子水清洗8次，用无菌吸水纸吸干水分，剪成1.5～2.0 cm2小块，接种到各愈伤组织诱导培养基上。接种20 d后观察统计愈伤组织诱导率及生长状况，愈伤组织经原诱导培养基继代培养2次后转入分化培养基诱导不定芽，40 d后统计分化率。以上各培养基均分别加入3%的蔗糖和0.8%的琼脂，pH值为5.8，（26±2）℃培养，光照强度2 000 lx，光照周期12 h/d，每个处理接种10瓶，每瓶接种3个外植体，重复3次。本研究中正交设计及所有数据的统计分析均使用正交设计助手ⅡV3.1软件。

2 结果与分析

2.1 不同培养基类型与激素水平对愈伤组织诱导率及生长状况的影响

将外植体接种到不同诱导培养基上，诱导率和生长差异很大。从表1可以看出，White培养基的各处理组合产生的愈伤组织诱导率及生长速度均显著低于其他2种培养基，同种培养基的各组合中6-BA浓度越大，生长速度越快，但同时褐化也加重。方差分析结果见表2。从表2可以看出，不同激素浓度对诱导率影响的极差R顺序为：培养基类型>6-BA>IBA，其中培养基类型对诱导率有显著影响（P

2.2 不同培养基类型与激素水平对愈伤组织分化率及丛生芽生长状况的影响

愈伤组织继代培养2次后转入分化培养基中，14 d左右少部分愈伤组织上出现绿色芽点，继而形成不定芽。正交试验方案及40 d后统计结果见表3，各处理愈伤分化率差异较大，正交试验方差分析结果见表4。从表4可以看出，不同激素浓度对诱导率影响的极差R顺序为：NAA >培养基类型>6-BA，促进愈伤组织产生的最佳处理组合是B5+6-BA 2 mg/L+NAA 1.0 mg/L，即为表3中的4号培养基，在此培养基上，不定芽分化率最高，达到66.7%，而且丛生芽生长密集（图2），芽长势良好，利于后期分割到单芽生长成不定苗（图3）。因此，愈伤组织芽分化的适宜培养基组合为B5+6-BA 2 mg/L+NAA 1.0 mg/L。

3 结论与讨论

试验结果表明，培养基类型对三叶青愈伤组织诱导率及生长状况均有显著的影响。以高盐的MS培养基诱导率高，增殖速度快，低无机盐的White培养基上的外植体逐渐干枯，切口处形成的愈伤组织也逐渐失去光泽，这可能是由于三叶青的愈伤组织生长需要较高的无机盐浓度。大量的研究表明[5-8]，培养基类型和激素水平是影响诱导率和分化率的重要因素。在诱导愈伤组织时常因植物的种类、外植体本身的生理状态等的不同而选用不同的培养基类型，这主要是因为不同外植体自身所含的营养成分不同，在组织培养中所要求的培养基也不同。在甘蓝等多种植物的组织培养中均发现MS培养基适于诱导愈伤组织和不定芽[5]。而本研究中三叶青愈伤组织的分化以高硝酸钾的B5培养基为最好，可能是因为不同外植体以及同一外植体的不同生长阶段所需求的营养成分不同所致，因此MS-B5交替继代方式有利于三叶青愈伤组织的继代与分化。在苜蓿花药愈伤组织继代和分化中也发现N6-MS培养基交替继代方式有利于愈伤组织胚性的保持，并使植株再生能力的下降有所减慢[6]。

本试验不同阶段培养基中外源性激素的种类和浓度配比事先均做过系统考察，正交试验激素质量浓度是在单因素试验的基础上选取效果较好的激素质量浓度进行设计的。前期试验结果表明IBA是最有利于三叶青愈伤组织诱导的外源性生长素，诱导率高且愈伤的褐化最轻；而在分化培养基中加入浓度大于1 mg/L的IBA，外植体上有不定根的发生，从而抑制芽的分化。因此，选择NAA作为分化培养的外源性生长素。

在植物组织培养中，植物的愈伤组织诱导和器官分化主要决定于植物体内细胞分裂素和生长素激素的比例，6-BA可以有效地诱导愈伤的产生与芽的萌发，本试验中当6-BA浓度超过4.0 mg/L时愈伤组织褐化明显加重，影响愈伤组织的继代培养，仅采用浓度1～4 mg/L的6-BA也能诱导愈伤组织的产生，但同时添加少量IBA的培养基中愈伤组织诱导率明显高于未添加IBA的培养基，说明少量的IBA对促进愈伤组织的形成有协同作用，尤以IBA 0.2 mg/L效果为佳。

不定芽的分化中选择6-BA和NAA浓度组合作为主要的研究因素。单独使用6-BA诱导不定芽分化，外植体上仅有愈伤组织的形成，没有不定芽的出现；而将6-BA与生长素NAA配合起来用，可以取得较好的不定芽分化效果，6-BA/NAA的浓度比值在一定范围内，随着比值的增高，不定芽分化率增加。6-BA浓度在1～4 mg/L范围内，不定芽分化率随其浓度的提高呈上升趋势。这一规律与辣椒的不定芽分化时相同[7]。本试验中愈伤组织在激素组合为6-BA 2 mg/L+NAA 1.0 mg/L时分化率最高，且不定芽分化的数量也最多，呈深绿色，长势也最强。另外，本试验还发现随着三叶青愈伤组织培养时间的延长和继代次数的增加，愈伤组织芽分化率基本呈逐渐增大的趋势，但继代次数超过3次以后，虽然芽分化率有所提高，但伴随着芽的褐化死亡。因此，选择继代2次的愈伤组织进行不定芽的分化培养。关于丛生芽的生根培养尚在进一步研究中。

4 参考文献

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[3] 钟毓倩.三叶青的组织培养与快速繁殖研究[J].浙江中医杂志，2007， 42（6）：363.

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[5] 李明银，黄丽梅.观赏型羽衣甘蓝组织培养影响因素的研究[J].北方园艺，2009（11）：99-101.

[6] 李增红，张博，陈爱萍，等.不同培养基对苜蓿花药愈伤组织继代和分化的影响[J].新疆农业科学，2008，45（5）：950-955.

[7] 于娅，孙翔.辣椒再生体系不定芽发生因素的优化研究[J].北方园艺，2011（5）：155-158.

[8] 曲同宝，孟繁勇，张友民.影响羊草愈伤组织分化因素的研究[J].安徽农业科学，2010，38（12）：6125-6127.