ERK在偏头痛动物模型中的激活及与肥大细胞脱颗粒间的关系
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摘要：目的观察皮下注射硝酸甘油（GTN）诱导大鼠偏头痛模型中硬脑膜、三叉神经核尾部磷酸化erk（p-ERK）的表达，及p-ERK表达与肥大细胞脱颗粒间的关系。方法24只雄性SD大鼠随机分为偏头痛模型组（n=18）和空白对照组（n=6）。模型组采用皮下注射GTN（10 mg/kg）法建立大鼠偏头痛模型，再将模型组大鼠随机分为3个亚组：C48/80组（腹腔注射C48/80，2 mg/kg）；SCG+ C48/80组（腹腔先注射SCG 10 mg/kg后再注射C48/80 2 mg/kg）和实验对照组（腹腔注射同等剂量的生理盐水）；空白对照组大鼠皮下注射等量生理盐水。模型组和空白对照组分别于15 min取硬脑膜和三叉神经核尾部。用免疫组织化学染色观察大鼠硬脑膜和三叉神经核尾部磷酸化ERK（p-ERK）的表达。结果ERK在模型组各亚组和空白对照组的硬脑膜和三叉神经核尾部都发生了磷酸化，但模型组各亚组p-ERK阳性免疫反应产物都明显高于空白对照组（P
关键词：偏头痛 细胞外信号调节激酶 肥大细胞 硬脑膜 三叉神经核尾部 硝酸甘油 大鼠
中图分类号：R747.2R255文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0587-03
偏头痛是一种反复发作的原发性脑功能障碍性疾病。WHO已将其列为世界范围内最容易影响日常生活和工作的疾病之一［1］，以及最容易致残的疾病之一,其致残性与四肢瘫痪相等同［2］。尽管偏头痛的发病率很高（我国患病率为0.99%，发达国家平均为12%），但其真正的病理生理学机制至今仍不清楚，对于其治疗亦存在诸多不足，即便是急性发作的特异性治疗，亦难获满意疗效。故对偏头痛的确切发病机制及治疗研究有待进一步深入进行。
细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是目前疼痛研究进展中备受关注的信号转导通路。ERK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase,MAPK) 家族中的一员。在初级传入伤害感受神经元周围末梢中存在丝裂原活化蛋白（MAP)激酶ERK的磷酸化形式（p-ERK）是这些伤害感受神经元兴奋的重要解剖学标志［3,4］。
肥大细胞脱颗粒能引起与其相邻的三叉神经脑膜伤害感受器持续激活，而这种激活是与p-ERK表达增加相伴随的［5］。本实验通过建立硝酸甘油（GTN）诱导的大鼠偏头痛模型，检测p-ERK的表达情况及p-ERK与肥大细胞脱颗粒间的关系，以探讨p-ERK在偏头痛发病过程中的病理生理作用，为偏头痛的治疗提供新的实验依据。
1材料与方法
1.1实验动物及分组24只健康雄性SD（250 g～300 g）大鼠，随机分为模型组（n=18）和空白对照组（n=6）。模型组采用皮下注射GTN（10 mg/kg）法建立大鼠偏头痛模型，再将模型组随机分为3亚组，每组6只，C48/80组（腹腔注射肥大细胞脱颗粒剂Compound48/80，2 mg/kg）；SCG+ C48/80组（SCG,10 mg/kg后再注射C48/80，2 mg/kg）和实验对照组（腹腔注射生理盐水 2 mg/kg ），模型组各亚组分别注射C48/80、SCG+C48/80、生理盐水，15 min后取硬脑膜和三叉神经核尾部标本。空白对照组大鼠皮下注射等量生理盐水，15 min后取标本。
1.2偏头痛模型制备采用皮下注射GTN制作偏头痛模型［6］,大鼠按10 mg/kg颈部皮下注射GTN（广州白云山明兴制药有限公司 批号:20090505）。5 min ～15 min大鼠出现双耳发红、后肢频繁挠头、爬笼次数增多等烦躁不安的现象,40 min～60 min达高峰。此现象可持续1 h～3 h,继之大鼠呈现蜷卧、活动减少状态。空白对照组大鼠皮下注射等剂量生理盐水。
1.3免疫组织化学将大鼠置于江湾Ⅰ型C立体定向仪上，取硬脑膜后取脑干(A系统定位于A 0.3 mm～5.7 mm,即耳间线后方0.3 mm～5.7 mm) ［7］，将所取硬脑膜和组织块立即置于4%多聚甲醛0.1 mol/L的PBS固定4 h后，移入含30%的0.1 mol/L PBS液中过夜沉底（4 ℃）。连续冰冻切片，厚度为5 μm。DAB显色、酸性甲苯胺蓝复染、脱水、透明，中性树胶封片。阴性对照染色切片中用PBS代替一抗，其余步骤相同，结果均为阴性。
1.4图像分析采用MIAS-2000图像分析系统,目标平均灰度级（G0)、视场平均灰度级(Gv )和目标面积与视场面积比(AAR),测试仪器的最大灰度分级(Gmax)为255,应用免疫组织化学定量计算公式计算阳性单位(positive unit,PU):
PU=|G0-Gv|(1-AAR)×Gmax×100
1.5统计学处理采用SPSS 13.0统计软件分析。正态分布数据以均数±标准差(x±s)表示,多组数据比较用完全随机设计资料的方差分析、LSD-t检验。
2结果
2.1免疫组织化学染色在模型组各亚组和空白对照组的硬脑膜和三叉神经核尾部均可见p-ERK的阳性免疫反应产物，前者阳性免疫产物染色较深且主要分布于脱颗粒的肥大细胞附近，后者阳性细胞染色较淡。即模型组各亚组大鼠硬脑膜、三叉神经尾核均有p-ERK的阳性免疫反应产物增强，镜下观察以C48/80组最为显著。
2.2PU值检测结果ERK在模型组各亚组和空白对照组的硬脑膜和三叉神经核尾部都发生了磷酸化，但模型组各亚组p-ERK阳性免疫反应产物都明显高于空白对照组（P
近年来大量研究表明，体内多种生理、病理性刺激，如：神经生长因子、激素、炎性细胞因子、缺血损伤、神经损伤、电惊厥休克、高渗、紫外线照射等［8-15］，均可引起脑内p-ERK的迅速增强，甚至在刺激后数分钟内即可观察到［13-15］。而其对不同刺激可产生增强和抑制双向变化，成为国内外研究神经元发生功能活动的标志之一。
在偏头痛发病机制的诸多学说中,三叉神经血管炎症学说近年来备受瞩目。受神经支配的硬脑膜痛觉纤维兴奋在偏头痛颅内疼痛中起重要作用［16-18］。肥大细胞遍布于人类［19］和啮齿类［20-22］动物的硬脑膜和脑内，围绕血管周围分布，与初级伤害感受神经元有较近的并置关系。在初级传入感受伤害神经元中伤害性刺激能引起一系列生化变化，研究表明，在初级传入感受伤害神经元周围末梢中存在MAP激酶ERK的磷酸化形式（p-ERK），是这些感受伤害神经元兴奋的重要解剖学标志［3,4］。肥大细胞脱颗粒能引起与其相邻的三叉神经脑膜伤害感受器持续激活，而这种激活是与p-ERK表达增加相伴随的［5］。Obata等［23］证明在产生痛觉敏化的过程中脊髓背角ERK的激活起了关键作用。Ji等［14］研究发现，ERK 在脊髓背角神经元中的激活是伤害特异性的。
本实验结果显示，在空白对照组大鼠硬脑膜和三叉神经核尾部内也出现少量p-ERK的表达，其原因是在未受刺激的正常动物脑内就有ERK磷酸化的现象。偏头痛模型组各亚组内均有p-ERK的表达，且明显高于空白对照组（P
参考文献：
［1］Lipton RB,Bigal ME.Migraine:Epidemiology,impact,and risk factors for progressin［Ｊ］.Headache,2005,45(Suppl 1):S3-S13.
［2］Goadsby PJ,Lipton RB.Fewari MD.Migraine-current understanding and treatment［Ｊ］.Neurology Meal,2002,346:257-270.
［3］Dai Y,Iwata K,Fukuoka T,et al.Phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase in primary afferent neurons by noxious stimuliand its involvement in peripheral sensitization［Ｊ］.J Neurosci,2002,22:7737-7745.
［4］Seino D,Tokunaga A,Tachibana T,et al.The role of ERK signaling and the P2X receptor on mechanical pain evoked by movement of inflamed knee joint［Ｊ］.Pain,2006,123:193-203.
［5］Dan L,Rami B,Vanessa K,et al.Mast cell degranulation activates a pain pathway underlying migraine headache［Ｊ］.Pain,2007,130(1-2):166-176.
［6］Tassorelli C,Joseph SA.Systemic nitroglyeerin induce fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structure of the rat［Ｊ］.Brain Res,1995,682:167-181.
［7］包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱［Ｍ］.北京:人民卫生出版社,1991:54-55.
［8］Alessandrini A,Namura S,Moskowitz MA,et al.MEK1 protein kinase inhibition protects against damage resulting from focal cerebral ischemia［Ｊ］.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:12866-12869.
［9］Murray B,Alessandrini A,Cole AJ,et al.Inhibition of the p44 /42 MAP kinase pathway protects hippocampal neurons in a cell culture model of seizure activity［Ｊ］.Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:11975-11980.
［10］Oh SW,Ahn YM,Kang UG,et al.Differential activation of c-Jun N-terminal protein kinase and p38 in rat hippocampus and cerebellum after electroconvulsive shock［Ｊ］.NeurosciLett,1999,271:101 -104.
［11］Meller E,Shen C,Nikolao TA,et al.Region-specific effects of acute and repeated restraint stress on the phosphorylation of mitogenactivated protein kinases［Ｊ］.Brain Res,2003,979:57-64.
［12］Morikawa Y,Ueyama E,Senba E.Fasting-induced acivation of mitogen-activatedproteinkinases(ERK/p38) inthemouse hypothalamus［Ｊ］.J Neuroendocrinol,2004,16:105-112.
［13］Khan AM,Watts AG.Intravenous 2-deoxy-D-glucase injection rapidly elevates levels of the phosphorylated forms of p44 /42 mito-gen-activated protein kinases(extracellularly regulated kinases 1/2) in rat hypothalamic parvicellular paraventricular neurons［Ｊ］.Endocrinology,2004;145:351-359.
［14］Ji RR,Baba H,Brenner GJ,et al.Nociceptive-specific activation of ERK in spinal neurons contributes to pain hypersensitivity［Ｊ］.Nat Neurosci,1999,2:1114-1119.
［15］Xu Z,Wang BR,Ding YQ,et al.Extracellular signal-regulated kinases1/2 in neurons of the dorsalmotor nucleus of the vagus nerve and nucleus of the solitary tract are activated by noxious visceral stimulus in mice［Ｊ］.Neurosci Lett,2002,334:103-106.
［16］Pietrobon D,Striessnig J.Neurobiology of migraine［Ｊ］.Nat Rev Neurosci,2003,4:386-398.
［17］Strassman AM,Raymond SA,Burstein R.Sensitization of meningeal sensory neurons and the origin of headaches［Ｊ］.Nature,1996,384:560-564.
［18］Waeber C,Moskowitz MA.Migraine as an inflammatory disorder［Ｊ］.Neurology,2005,64:S9-S15.
［19］Artico M,Cavallotti C.Catecholaminergic and acetylcholine esterase containing nerves of cranial and spinal dura mater in humans and rodents［Ｊ］.Microsc Res Tech,2001,53:212-220.
［20］Dimitriadou V,Buzzi MG,Moskowitz MA,et al.Trigeminal sensory fiber stimulation induces morphological changes reflecting secretion in rat dura mater mast cells［Ｊ］.Neuroscience,1991,44:97-112.
［21］Rozniecki JJ,Dimitriadou V,Lambracht-Hall M,et al.Morphological and functional demonstration of rat dura mater mast cell-neuron interactions in vitro and in vivo［Ｊ］.Brain Res,1999,849:1-15.
［22］Strassman AM,Weissner W,Williams M,et al.Axon diameters and intradural trajectories of the dural innervation in the rat［Ｊ］.J Comp Neurol,2004,473:364-376.
［23］Obata K,Yamanaka H.Differential activation of MAPK in injured and uninjured DRG neurons following chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats［Ｊ］.Eur J Neurosci,2004,20:2881-2895.
作者简介：赵丽娟，女，现为山西医科大学第一医院神经内科在读硕士研究生（邮编：030001）；牛争平（通讯作者），工作于山西医科大学第一医院（邮编：030001）。
（收稿日期：2011-01-18）