归脾汤对抑郁模型大鼠血清皮质酮雌激素含量影响的实验研究
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摘要：目的：观察归脾汤对慢性不可预见性模型大鼠血清皮质酮、雌激素(E2)水平的影响，初步探讨其防治抑郁症的可能机制。方法：选择体重、行为学评分相近的普通级Wistar雌性大鼠40只，按随机原则分为对照-组、模型组、盐水组、中药组。应用慢性不可预见性中等强度应激复制抑郁症动物模型。观察归脾汤对该模型大鼠的作用。定期测定各组大鼠体重及其行为的改变；利用放免法测定大鼠血清中皮质酮及E2含量。结果：模型组大鼠体重、水平和垂直运动得分、逃避潜伏时和游过的距离、血清中皮质酮、E2含量均与对照组有显著差异；而中药组大鼠以上各指标均与对照组无明显差异。结论：①归脾汤能够对抗模型大鼠血清皮质酮的异常分泌。②归脾汤能够维持模型大鼠血清E2正常分泌。③归脾汤抗抑郁症的作用可能与维持皮质酮、E2的正常分泌有关。
关键词：归脾汤；抑郁症；不可预见性应激；皮质酮；雌激素
中图分类号：R-33 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)11-2349-03
抑郁症是常见的情感障碍，其发病机制目前尚不十分确切，但海马神经细胞损伤及再生障碍可能是主要原因。据报道，血清中高浓度皮质酮可引起海马神经细胞胞内Ca2超载，而胞内Ca2超载可导致细胞损伤已成为公认事实。同时大量研究表明，生理性雌激素可以促进神经元生长，阻止神经元细胞萎缩，调节突触的可塑性，促进神经元细胞再生。
归脾汤具有益气补血、健脾养心之功，主治心脾两虚、气血不足之证。临床应用归脾汤治疗抑郁症取得满意疗效。但有关归脾汤抗抑郁机理的研究较少。因此本实验主要从整体水平观察归脾汤对抑郁模型大鼠的影响，并初步探讨其可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
健康雌性普通级Wistar大鼠，体重(220±20)g，由辽宁中医药大学动物实验中心提供。自由进食饮水，室温适应性饲养。
1.2 实验仪器
自制Open―field行为学检测箱，B12000―Morris水迷宫视频跟踪分析系统，DFlVl―96型10管放射免疫Y计数器，Olympus荧光显微镜。
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组将大鼠适应性喂养1周后，选择体重、行为学得分和学习记忆能力相近的40只大鼠，随机分为对照组、抑郁症模型组(模型组)、抑郁症模型+生理盐水组(盐水组)和抑郁症模型+归脾汤组(中药组)，每组10只。
1.3.2 抑郁模型的建立除对照组外，其余3组均建立改进的慢性不可预见性应激模型。方法是在21天内对大鼠施加电击足底(36V交流电，5min)、冰水游泳(4℃，5min)、摇晃(5min)、夹尾(1min)，禁水(24h)，禁食(24h)等刺激，每天一种刺激方法，随机施加，使动物不能预见刺激的种类，每种刺激重复3～4次。
1.3.3 药物及给药方法归脾汤组成：白术30g，茯神30g，黄芪30g，龙眼肉30g，酸枣仁30g，人参15g，木香15g，甘草8g，当归3g，远志3g，购于辽宁中医药大学附属医院药局。按常规方法煎煮，浓缩至2g／mL，4℃冰箱保存备用。对照组不给药；模型组只施加灌胃动作但不给药；盐水组于每次刺激前半小时灌服2mL生理盐水；中药组，根据临床成人用量折算成大鼠灌胃剂量，每天给药1mL／100g，于每次刺激前半小时灌服，共给药21天。
1.3.4 大鼠体重和行为学评分的测量大鼠体重的测量在实验开始的第0天和第22天的同一时间，按照大鼠序号进行测量。大鼠行为学评分的测量在实验开始的第0天和第22天，于大鼠测量完体重后用Open--field法进行检测。
1.3.5 大鼠学习记忆能力的测验在实验开始的第O天和第22天，用Morris水迷宫视频跟踪分析系统进行测量。正式检测前对大鼠进行训练，每天训练2次，连续7天。正式检测时，以3rain内大鼠找到休息平台所游过的距离和逃避潜伏时作为评价标准，同时记录其游过的路线图。
1.3.6 大鼠血清皮质酮E2 FSH LH水平检测在实验进行的第22天，大鼠经20％乌拉坦(0.4mL／100g)麻醉后，腹主动脉取血2mL，离心后取血清，低温冷藏备用。采用放免法检测血清皮质酮、雌激素浓度，此项工作由总医院内分泌实验室协助完成。
1.3.7 数据处理数据以x±s形式表示，采用SPSS 10.0统计软件处理，统计方法采用ANOVA法、单因素方差分析和两两比较，如不满足方差分析条件时用秩和检验。
2 结果
实验过程中没有实验动物的死亡及脱失情况发生，各组有效例数均为10例。
2.1 各组大鼠体重的改变
由表1结果显示：①第0天各组大鼠体重无差异。②第22天，模型组和盐水组大鼠体重较对照组显著下降(P
2.2 各组大鼠行为学评分
对照组大鼠进入检测箱后，迅速离开中央区域，多数爬向较暗的一侧区域，在原地观察几秒钟后，开始沿着检测箱的四周区域进行探索，每到一个角落时大多出现1～2次垂直活动，在探索过程中动作较快且很少在中心区域活动。模型组大鼠进入检测箱后，多数缓慢离开中央区域，爬到较暗区域后通常先静止几秒钟，才开始进行探索，在探索过程中动作较慢，且多次通过中央区域，最后停留在检测箱一角，静止不动，直到时间耗尽。盐水组大鼠的表现与模型组相似。中药组大鼠的表现与对照组相似。
从表2中可以看出：①第0天各组大鼠的两项得分之间均没有显著差异。②第22天，模型组和盐水组大鼠的两项得分较对照组均显著降低，而中药组大鼠的得分与对照组相比无显著差异，模型组大鼠与盐水组大鼠的两项得分间无显著差异。
2.3 各组大鼠的逃避潜伏时间和游泳距离的测定
对照组大鼠进入Morris水迷宫后，多数立即游向中央区域，在休息平台附近摸索一段时间后即可找到平台，模型组大鼠进入Morris水迷宫后，多数沿桶壁边缘进行搜索，远离休息平台所在区域，虽然可在规定时间内找到休息平台，但所游过的距离和所用时间均明显延长；盐水组大鼠进入Morris水迷宫后的表现与模型组相似；中药组大鼠进入Morris水迷宫后的表现与对照组相似。
由表3可以看出：①第0天4组大鼠的两项指标均无显著差异。②第22天，模型组和盐水组大鼠的两项指标与对照组相比均显著增加，中药组大鼠的两项指标较对照组无明显变化，模型组大鼠与盐水组大鼠的两项指标间无显著差异。
2.4 大鼠血清皮质酮E2FSH LH检测结果
模型组和盐水组大鼠血清皮质酮浓度与对照组相比显
著升高，中药组较对照组无显著变化，盐水组较模型组无显著变化(表4)。模型组和盐水组大鼠血清E2含量明显低于对照组和中药组，模型组和盐水组及对照组和中药组大鼠血清E2含量两两比较无差异；与对照组相比，模型组和盐水组FSH、LH含量显著增加，中药组则无明显变化；模型组和盐水组组间无显著差异；中药组含量明显低于模型组和盐水组。见表4。
3 讨论
最早由Duman等在2000年提出，海马神经发生与抑郁症的发病机制有关。海马是边缘系统的重要组成结构，对情绪和学习记忆极为重要，其损伤与体内多种细胞因子及激素含量的变化有关。脑成像研究也证明抑郁症患者左右两侧海马较之正常人显著缩小，并且其缩小程度与应激作用时间呈正相关。因此通过各种途径有效的保护海马，促进神经细胞的再生，已成为抗抑郁症治疗和药物开发的主要方向。
研究证实，血中持续高水平的皮质酮通过海马盐皮质激素受体与糖皮质激素受体抑制缝核一海马系统5羟色胺能神经元活性并损伤海马神经元。临床观察到抑郁症患者血浆皮质酮水平升高，皮质酮水平与抑郁症严重程度可有关，经抗抑郁剂治疗后可使血浆皮质酮水平下降，因而可以说明血浆及脑脊液中的皮质酮水平的持续升高，对海马神经元的损伤和再生功能具有影响，对抑郁症的发生可能起到至关重要的作用。
同时近年来临床治疗发现抑郁症患者中女性多于男性，且抑郁症的发病与体内雌激素水平有密切关系。抑郁症患者血清中E2含量明显低于正常人群，而FSH、LH含量高于正常人群。临床应用雌一孕激素序贯疗法治疗更年期抑郁症，可升高患者血清性激素水平，并改善患者的临床症状。但是雌激素有诱发乳腺癌和子宫内膜癌的副作用，这就限制了其抗抑郁作用的临床应用，因此从植物药中寻找具有抗抑郁的天然药物已成为国际抗抑郁的新方向。
中药成方归脾汤出自南宋严用和《严氏济生方》，以往的研究发现其具有抗抑郁作用，并且可以双向调节女性雌、孕激素水平。苗林应用二陈归脾汤加味治疗老年性抑郁症，结果显示有总效率达87.5％。谢珍应用甘麦大枣汤合归脾汤加减治疗更年期抑郁症，治疗组治愈率为59.55％，总有效率为96.49％。国外学者报道，归脾汤对包括抑郁症在内的多种神经系统症状有治疗作用。患者加服归脾汤后，多种神经精神症状明显改善，停用抗精神失常药物者达29.7％，减量者达46.0％。抑郁症患者自卑感、抑郁状态改善，逐渐恢复自信、明朗的性格。
本课题研究中，实验动物经21天造模后，模型组大鼠出现毛色暗、脱毛、少食、少动、易惊、学习和记忆能力下降等症状、体征。模型组大鼠与对照组比较，体重和行为学评分均降低，具有统计学意义(P
归脾汤抗抑郁的作用机制可能是通过调节体内皮质酮含量的异常变化，从而减轻因细胞内Ca2+的超载所导致地对神经细胞的毒性作用。同时维持雌激素的正常分泌，提高海马及大脑其它区域的5-HT的含量，促进5-HT与5-HTIA受体相结合，启动细胞内反应过程，降低NMDA介导的胞内钙超载和氧化自由基的细胞毒性作用。同时雌激素与神经营养因子(NGF)相互作，影响细胞凋亡基因的信号转导，保护神经细胞并促进其损伤后的再生，因而可增强单胺类神经递质活性和突出后5-HT能效应，增加5-HT能受体数量和神经的转运和吸收，从而调节情绪、习惯和认识功能，改善抑郁状态。
综上结果说明，归脾汤可以对抗不可预见性应激大鼠模型血清皮质酮的异常分泌，维持血清雌激素的含量，有效保护海马神经元的损伤，对抗大鼠抑郁症状的出现。但本实验研究未对两种物质作用的相应受体进行检测，其作用的细胞信号途径及具体靶点仍须进一步探讨。相信通过深入的研究将为中医药抗抑郁症的治疗提供新的途径。