免疫抑制剂FTY720对小鼠肝移植瘤抑制作用的研究

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[摘要] 目的：探讨FTY720的免疫抑制作用及其对小鼠肝移植瘤的抑制作用。方法：小鼠肝癌Hepa1-6细胞按2×106/只的量接种于C57BL/6j小鼠皮下。当C57BL/6j小鼠移植瘤直径至0.30 cm，将40只成瘤小鼠随机分为4组，分别用以下药物灌胃10 d，环孢素组：环孢素10 mg/(kg・d)；FTY720组：FTY720 3 mg/(kg・d)；5-氟尿嘧啶（5-Fu）组：5-Fu 50 mg/(kg・d)；生理盐水组：0.9%氯化钠注射液1 mg/(kg・d)。检测胸腺、脾指数、外周血T淋巴细胞计数、肿瘤体积、外周血甲胎蛋白、凋亡指数、瘤体Bcl-2和Caspase-3的表达。结果：环孢素组和FTY720组胸腺、脾指数及T淋巴细胞百分比低于生理盐水组（P＜0.05，P＜0.01）；而5-氟尿嘧啶组与生理盐水组比较，差异无显著性（P＞0.05）；5-氟尿嘧啶组与FTY720组肿瘤体积与甲胎蛋白含量低于生理盐水组（P＜0.05，P＜0.01），凋亡指数高于生理盐水组（P＜0.05，P＜0.01）；而环孢素组与生理盐水组比较，差异无显著性（P＞0.05）；5-氟尿嘧啶组和FTY720组小鼠瘤体Bcl-2的表达低于生理盐水组（P＜0.05），而环孢素组与生理盐水组比较，差异无显著性（P＞0.05）；5-氟尿嘧啶组小鼠瘤体Caspase-3的表达低于生理盐水组（P＜0.01）；而FTY720组和环孢素组与生理盐水组比较，差异无显著性（P＞0.05）。结论：FTY720同时具有免疫抑制作用和抗肿瘤作用，而其抗肿瘤作用与Bcl-2的表达降低有关。

[关键词] 免疫抑制作用；抗肿瘤作用；FTY720；Bcl-2；Caspase-3

[中图分类号] R735.7[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）05（a）-021-03

Study on the antitumor activity of the immunosuppressive agent FTY720 to hepatocellular transplanted tumor in mice

YANG Haibo1, ZHAO Haoliang2, HE Jiefeng2, XUE Wei1

(1.Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2.The First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

[Abstract] Objective: To study the immunosuppression and antitumor activity of FTY720 to hepatocellular transplanted tumor in mice. Methods: Mice liver cancer Hepa1-6 cells were collected and injected subcutaneously with a dose of 2×106/mouse into C57BL/6j mice. When the diameter of the hepatocellular transplanted tumor reached 0.30 cm, 40 C57BL/6j mice were randomly divided into four groups, each group was lavaged for 10 days with the following medicine separately, Ciclosporin group: Ciclosporin 10 mg/(kg・d); FTY720 group: FTY720 3 mg/(kg・d); 5-Fu group: 5-Fu 50 mg/(kg・d); NS group: NS 1 mg/(kg・d). Then thymus gland and spleen index, the percentage of peripheral blood T-lymphocyte, gross tumor volume, secretory volume of AFP in serum, apoptosis index as well as the expression of Caspase-3 and Bcl-2 were investigated. Results: Thymus gland and spleen index and the percentage of T-lymphocyte in Ciclosporin group and FTY720 group were lower than that of NS group (P＜0.05, P＜0.01), there was no significant difference between NS group and 5-Fu group (P＞0.05); the gross tumor volume and secretory volume of AFP in serum in 5-Fu group and FTY720 group were lower than that of NS group (P＜0.05, P＜0.01), and the apoptosis index was higher than that of NS group (P＜0.05, P＜0.01), there was no significant difference between NS group and Ciclosporin group (P＞0.05); the expression of Bcl-2 in 5-Fu group and FTY720 group was lower than that of NS group (P＜0.05), there was no significant difference between NS group and Ciclosporin group (P＞0.05); the expression of Caspase-3 in 5-Fu group was lower than that of NS group (P＜0.01), there was no significant difference between NS group and FTY720 group as well as Ciclosporin group (P＞0.05). Conclusion: FTY720 has immunosuppression and antitumor activity, the antitumor activity is associated with the lower expression of Bcl-2.

[Key words] Immunosuppression; Antitumor activity; FTY720; Bcl-2; Caspase-3

原发性肝癌（HCC）是世界范围内一种常见的恶性消化道肿瘤之一，其恶性程度高，发展迅速，病死率高。对于进展期肝癌，特别是不能手术切除者，肝移植是生存的唯一机会。肿瘤的复发和转移以及免疫排斥是肝癌肝移植后两大难题。

FTY720是冬虫夏草分离出的活性成分ISP-1[1]，经去除手性中心，改变侧链得到的氨基丙二醇化合物[2]，目前主要用于抑制器官移植所引起的排斥反应[3]，有研究发现，它可用于治疗某些原发性及转移性癌症[4]。本实验对FTY720对小鼠免疫抑制及抗肝移植瘤作用进行研究，从而为临床治疗肝癌后肝移植提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物与细胞株：实验动物为4周龄雌性清洁级（SPF）C57BL/6j小鼠，购自北京中科院试验动物中心，饲养于山西医科大学试验动物中心。Hepa1-6肝癌细胞购自中国科学院。

主要试剂：FTY720（南京安格医药化工有限公司），RPMI 1640培养基、胎牛血清（美国GIBCO公司），兔抗鼠Bcl-2单克隆抗体（编号BAO412，批号20081003）、兔抗鼠Caspase-3单克隆抗体（编号BAO588，批号20081003）、凋亡的原位末端标记（TUNEL）检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立Hepa1-6细胞传代3～4次后，取指数生长期细胞，PBS重悬，浓缩为2×107/ml，按0.1 ml/只的量接种于C57BL/6j小鼠腰胁部皮下。当C57BL/6j小鼠移植瘤直径至0.30 cm，将40只成瘤小鼠随机分为4组，分别做如下处理，环孢素组：环孢素10 mg/(kg・d)灌胃；FTY720组：FTY720 3 mg/(kg・d)灌胃[3 mg/(kg・d)为FTY720作为免疫抑制剂的常用剂量[5]；5-Fu组：5-Fu 50 mg/(kg・d)灌胃；生理盐水组：0.9%氯化钠注射液1 mg/(kg・d)灌胃。连续灌胃10 d，给药结束次日处死小鼠，剥离瘤体。

1.2.2 外周血T淋巴细胞百分比测定连续给药10 d，于末次给药后1 h，剪鼠尾取血涂片，自然干燥后，浸入37℃孵育液（已预热30 min）中孵育3 h，自来水冲洗，加1％孔雀绿溶液染色8 s，自来水冲洗，晾干后油镜检查，每只小鼠血涂片标本均查100个淋巴细胞，计算T淋巴细胞的百分比。

1.2.3 胸腺、脾指数测定连续给药10 d，末次给药后次日称重，麻醉下眼眶放血处死，剥取胸腺、脾，电子天平称重，计算胸腺（脾）指数=[胸腺（脾）重量（mg）/体重（g）]。

1.2.4 肿瘤体积测定用游标卡尺测定肿瘤最长径（a）和最短径（b），以公式V=π/6ab2计算肿瘤体积。

1.2.5 周围血甲胎蛋白（AFP）测定处死前，采用摘眼球采血的方法获得血液，用生化法检测AFP的分泌量。

1.2.6 原位细胞凋亡检测参照TUNEL检测说明书，组织切片逐级脱蜡，水化，蛋白酶K消化后，分别与TUNEL反应混合液及转化剂POD 37℃孵育，DAB显色，对比染色，脱水、透明后封片观察。实验同时设阳性和阴性对照，普通光镜下观察，随机选取5个高倍视野，计数1 000个细胞，计算阳性细胞数占肿瘤细胞的百分比，作为凋亡指数（apoptosis index，AI）。

1.2.7 免疫组化SABC法检测Bcl-2和Caspase-3切片常规脱蜡至水，滴加3% H2O2室温10 min，蒸馏水洗3 min×3次，微波修复抗原，滴加5% BSA血清封闭液，室温20 min，滴加一抗（兔抗鼠Caspase-3、Bcl-2 IgG），37℃孵育120 min，PBS洗2 min×3次，滴加二抗（生物素标记山羊抗兔IgG），37℃孵育20 min，PBS洗2 min×3次，滴加试剂SABC，37℃反应20 min，PBS洗5 min×4次，DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。在100倍光学显微镜下观察，随机选择5个视野，采用JEOA801D 610图像分析软件测定阳性细胞的平均光密度（OD）值。

1.3 统计学方法

数据以均数±标准差（x±s）表示，组间数据比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析

参加实验的40只小鼠全部进入结果分析，没有脱失。

2.2 各药物组小鼠胸腺、脾指数以及外周血T淋巴细胞百分比的检测

见表1。

表1 各药物组对小鼠胸腺、脾指数以及外周血

T淋巴细胞百分比的影响（x±s）

与生理盐水组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

表1结果表明，与生理盐水组比较，环孢素组和fty720组可显著降低小鼠胸腺及脾指数，降低小鼠外周血T淋巴细胞百分比，差异有显著性；而5-氟尿嘧啶组差异无显著性。

2.3 各药物组小鼠瘤体体积、甲胎蛋白及凋亡指数的检测

见表2、图1。

表2 各药物组对小鼠瘤体体积、甲胎蛋白、

凋亡指数的影响（x±s）

与生理盐水组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

图1各药物组对小鼠瘤体体积的影响

（A：生理盐水组；B：5-氟尿嘧啶组；C：环孢素组；D：FTY720组）

以上结果表明，与生理盐水组比较，5-氟尿嘧啶组和FTY 720组可显著减小肿瘤体积、减少甲胎蛋白的分泌量、增加凋亡指数，差异有显著性；而环孢素组差异无显著性。

2.4 各药物组小鼠瘤体Bcl-2及Caspase-3表达的检测

见表3、图2。

表3 各药物组对小鼠瘤体Bcl-2及Caspase-3表达的影响（x±s）

与生理盐水组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

图2 各药物组对小鼠瘤体Bcl-2表达的影响

（A：生理盐水组；B：5-氟尿嘧啶组；C：环孢素组；D：FTY720组；SP×400）

以上结果表明，与生理盐水组比较，5-氟尿嘧啶组和FTY20组可显著降低Bcl-2的表达，差异有显著性；而环孢素组差异无显著性。与生理盐水组比较，5-氟尿嘧啶组可显著降低Caspase-3的表达，差异有显著性；而FTY720组和环孢素组差异无显著性。

3 讨论

小鼠Hepa1-6肝癌细胞是由C57BL/6j小鼠正常上皮细胞诱导纯化而成，源自C57BL/6j小鼠BW7756肝癌细胞株的一个衍生物，该细胞株低表达MHC类分子和B-7分子，恶性度高而免疫原性弱[6]。另外，本研究以C57BL/6j小鼠为接种对象，保证了肿瘤细胞和荷瘤宿主的同源性，保证肿瘤模型建立的可行性以及消除免疫排斥造成的偏倚。

本实验结果表明，FTY720和环孢素能降低胸腺、脾指数和T淋巴细胞百分比，表明它们具有免疫抑制作用。5-氟尿嘧啶和FTY720能减小肿瘤体积、减少甲胎蛋白的分泌量、增加凋亡指数，表明它们有抗肿瘤作用。

与FTY720组相比，5-氟尿嘧啶组可显著减小肿瘤体积、减少甲胎蛋白的分泌量、增加凋亡指数，差异有显著性（P＜0.05），并不表示5-氟尿嘧啶的抗肿瘤作用强于FTY720，机体的抗肿瘤免疫反应主要是细胞免疫，其效应细胞有CTL细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞等。免疫功能低下者，恶性肿瘤的发生率明显增加，免疫抑制作用同时也抑制机体的抗肿瘤作用。本研究所反映FTY720的抗肿瘤作用是免疫抑制作用与抗肿瘤作用共同作用的结果。与环孢素组相比，FTY720组能显著降低小鼠胸腺指数、脾指数以及T淋巴细胞百分比，差异有显著性（P＜0.05），而且可显著减小肿瘤体积、减少甲胎蛋白的分泌量、增加凋亡指数，差异有显著性（P＜0.05）。由此可见，FTY720在免疫抑制作用方面及抗肿瘤方面都优于单纯免疫抑制剂环孢素。

FTY720能使Bcl-2的表达降低，而不能使Caspase-3的表达显著升高。Bcl-2是一种原癌基因，可以阻断细胞程序化死亡的公共信号传导通路。因此，FTY720的抗肿瘤作用与Bcl-2的表达降低有关。

有研究表明，FTY720免疫抑制作用主要通过阻滞鞘氨醇-1-磷酸盐（S1P）受体起作用，在体内主要经鞘氨醇激酶-2作用转化成单磷酸酯化合物（FTY720-P）发挥作用[7]。FTY720应用于肝移植后患者，能大大改善其存活时间[8]。Kohno等[9]报道，FTY720可诱导加快膀胱癌、乳腺癌和胶质瘤等癌细胞的凋亡。Haruhito等[10]研究发现，FTY720呈剂量依赖性诱导乳腺癌细胞系生长停滞和凋亡。

综上所述，FTY720同时具有免疫抑制作用和抗肿瘤作用。免疫排斥和肿瘤复发是肝癌后肝移植的两大难题，也是肿瘤移植治疗的两大难题。由此可见，FTY720在肿瘤的移植治疗中有广阔的应用前景。

[参考文献]

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[10]Haruhito A, Shiro T, Naotsugu L,et al. Marked prevention of tumor growth and metastasis by a novel immunosuppressive agent,FTY720,in mouse breast [J]. Cancer Research,2002,62(S):1410-1419.

（收稿日期：2009-01-03）