UPLC法测定蚕用甲醛溶液中甲醛的含量

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【摘要】建立超高效液相色谱法测定蚕用甲醛溶液中甲醛含量的方法。方法：采用反向高效液相色谱法，ACQUITY uplc? HSS T3色谱柱，以35：65比例的甲醇和水为流动相，流速0.4ml·min-1，检测波长为348 nm，测定蚕用甲醛溶液中甲醛的含量，并将其与传统容量法结果进行比较。结果：甲醛在浓度0.5μg·ml-1～40μg·ml-1范围内的线性良好，相关系数r为0.9999，含量平均值和容量法进行比较，相对偏差在1.0%以内，结果无显著差异。结论：本方法操作简便、灵敏度高、重现性好，可作为蚕用甲醛溶液的质量控制方法。

【关键词】蚕用甲醛溶液；超高效液相色谱法；甲醛；含量测定

甲醛（HCHO）是挥发性有机化合物，是一种原生质毒，对眼部及呼吸、神经和内分泌等系统有毒害性，此外还有致癌、致突变的遗传效应。但由于其亲水性好、杀菌率高、价格低廉以及不受体系中酸碱度影响等优点，常用作消毒剂和防腐剂[1]。蚕用甲醛溶液为消毒药，能使微生物蛋白质凝固变性，使病原微生物死亡，用于蚕室、蚕具和卵面消毒。蚕用甲醛溶液收载于农业部1435号公告，标准采用容量法测定甲醛含量[2]。容量分析法（也称滴定法），是将已知浓度的滴定液由滴定管滴加到被测药物的溶液中，直至滴定液与被测药物反应完全（通过适当方法指示），然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系计算出被测药物的含量。容量分析法所用仪器价廉易得，操作简便、快速，方法耐用性高，测定结果准确，通常情况下其相对误差在0.2%以下，被广泛应用于化学原料药的含量测定，但该法的专属性（选择性）较差。因此，研究并建立一种高效、准确的超高效液相色谱法测定蚕用甲醛溶液的含量有重要意义。本文建立的方法操作简便，灵敏度高，重现性好，为蚕用甲醛溶液的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Waters ACQUITYTM超高效液相色谱仪，配TUV检测器；AG-285电子天平（Mettler公司）；TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。

水中甲醛溶液标准物质为中国计量科学研究院，批号为12002，纯度为10.1 mg·ml-1；甲醛-2，4-二硝基苯腙标准品为AccuStandard公司产品，批号为212101191，纯度为0.1 mg·ml-1；2，4-二硝基苯肼为国药集团化学试剂有限公司产品，为分析纯，批号为F20090410；盐酸，为分析纯，杭州化学试剂有限公司产品，批号20120906，纯度为36.0%～38.0%；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 液相方法

2.1.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC? HSS T3 1.8μm，2.1mm×100 mm；检测波长：348 nm；进样量：5μL；流动相：甲醇-水（35：65）；柱温：30℃；流速：0.4 ml·min-1。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密称取甲醛溶液（蚕用）0.3 g，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度；取1.00 ml置100 ml量瓶中，用水稀释至刻度，为含甲醛约为10μg·ml-1的溶液。

2.1.3 衍生化试剂制备

称取2，4-二硝基苯肼100 mg，溶解于24 ml盐酸中，加水稀释至100 ml[2，3]。

2.1.4 标准工作液制备

精密量取水中甲醛溶液标准物质1ml置100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，浓度为101μg·ml-1。

2.1.5 衍生化反应

取甲醛对照品溶液供试品溶液5.00ml，置10ml具塞比色管中，加入2ml衍生化溶液和3ml乙腈，置60℃水浴中20min，快速冷却，UPLC分析测定。

2.1.6 线性关系考察

分别吸取一定量的标准工作液，用水稀释成浓度为0.5μg·ml-1～40μg·ml-1的标准系列工作溶液，临用新配。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=2.90×105X+5.91×104，相关系数r为0.9999，表明甲醛在浓度0.5μg·ml-1～40μg·ml-1范围内的线性良好。

图1 甲醛对照品标准曲线

2.1.7 精密度试验

吸取20μg·ml-1的甲醛标准溶液衍生化后的溶液，连续进样5次，测定峰面积，结果RSD为0.3%，表明精密度良好。

2.1.8 稳定性试验

取精密度试验的溶液，分别在放置0h、2h、4h、6h、8 h再进样测定，RSD为0.5%，表明稳定性良好。

2.1.9 专属性试验

取对照品溶液、供试品溶液与阴性样品，分别进样测定。供试品与对照品在同一保留时间有相同的峰出现，而阴性样品则无相应的峰（见图2，3，4）。

图2 甲醛对照品溶液的超高效液相色谱图

图3 甲醛对照品溶液的超高效液相色谱图

图4 甲醛供试品溶液的超高效液相色谱图

2.2 容量法

取本品约1. 5ml，精密称定，加水10ml、过氧化氢试液25ml与溴麝香草酚蓝指示液2滴，滴加氢氧化钠滴定液（1 mol/L）至溶液显蓝色；再精密加氢氧化钠滴定液（1 mol/L）25ml，瓶口置一玻璃小漏斗，置水浴上加热15min，不时振摇，放冷，用水洗涤漏斗，加溴麝香草酚蓝指示液2滴，用盐酸滴定液（1 mol/L）滴定至溶液显黄色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1 ml氢氧化钠滴定液（1 mol/L）相当于30.03mg的CH2O。

2.3 结果比较

以建立的UPLC法测定蚕用甲醛溶液中甲醛的含量和容量法测定的进行比较，结果含量平均值的相对偏差在1.0%以内，结果无显著差异。

表1 UPLC与容量法测定甲醛溶液（蚕用）含量结果比较

批 号 20120501 20120502 20120503

UPLC（%） 37.1 37.8 37.6

容量法（%） 37.5 38.2 37.8

相对偏差（%） 0.5 0.4 0.3

3 讨论

3.1 检测波长的选择

查阅文献可知，甲醛和衍生化溶液反应，生成甲醛-2，4-二硝基苯腙，为了确定最佳检测波长，我们采用紫外分光光度法对最佳检测波长进行了考察。用甲醇溶解甲醛-2，4-二硝基苯腙对照品并稀释至5μg·ml-1，参照紫外可见分光光度法，在200nm～400nm的波长范围进行扫描，在348nm的波长处有最大吸收（见图5）。因此，我们选择348nm作为检测波长。

图5 甲醛-2，4-二硝基苯腙对照品溶液的紫外光吸收谱图

3.2 流动相的选择

超高效液相色谱柱ACQUITY uplc? HSST3 1.8μm 2.1mm×100mm，可以对甲醛进行分离，以比例为35：65的甲醇和水作为流动相时[4]，甲醛峰形较好，没有干扰，保留时间3.00min，满足检测要求。

3.3 衍生反应条件的确定

考察了衍生反应温度、衍生剂用量、反应时间等因素的影响[5]。分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下进行衍生反应，产物经UPLC检测，发现60℃下衍生物的峰面积达到最大；分别加入0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml衍生化试剂进行反应，峰面积在2.0ml达到最大；分别对衍生时间为10min、20min、30min、40min、50min、60min时的色谱峰面积进行考察，发现在20min内反应完全，色谱峰面积达到最大。因此，选择衍生化试剂用量2ml、水浴温度60℃和水浴时间20min。

参考文献

[1]方桂红，徐莉，纪少凡.超高液相色谱法测定食品中甲醛含量[J].食品研究与开发，2012，33（9）：154-156.

[2]兽药国家标准汇编（第一册）[S].124-125.

[3]韩军，花卉，冯立.超高效液相色谱法测定皮革中甲醛含量[J].西部皮革，2010，32（9）：26-28.

[4]佟琦，王志斌，崔海莹，等.高效液相色谱法对粉条中甲醛含量的快速检[J].分析测试学报，2011，30（12）：1392-1395.

[5]韩军，花卉，冯立.超高效液相色谱法测定皮革中甲醛含量[J].西部皮革，2010，32（9）：26-28.