柑橘全爪螨代谢抗性相关基因表达差异分析
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摘 要： 【目的】为了明确谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因、羧酸酯酶（CarE）基因，过氧化氢酶（CAT）基因在柑橘全爪螨Panonychus citri抗性中的作用，【方法】在室内用噻螨酮对柑橘全爪螨进行抗性选育，进一步构建抗/敏品系数字基因表达谱，采用RPKM法对柑橘全爪螨敏感品系和噻螨酮抗性品系3种代谢抗性相关基因进行表达差异分析。【结果】经过20代抗性选育，获得了柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系，与敏感品系比较，柑橘全爪螨对噻螨酮的抗性倍数达到3 532.12倍。基因差异性分析发现，抗性品系中有11条GST基因、17条CarE基因和6条 CAT基因表达上调；14条GST基因、24条CarE基因和3条 CAT基因表达下调。上调倍数最高的GST基因、CarE基因和CAT基因分别为Unigene31530 [log2 ratio（RS/SS）=1.05]、Unigene23121 [log2 ratio（RS/SS）=2.05]和Unigene31477 [log2 ratio（RS/SS）=10.04]。进一步对Unigene31477进行荧光定量PCR分析发现，抗性和敏感品系基因表达水平没有显著差异。【结论】根据柑橘全爪螨抗/敏性品系基因表达差异推断，GST、CarE和CAT基因可能与柑橘全爪螨对噻螨酮产生的抗性没有密切关系。
关键词： 柑橘全爪螨； 噻螨酮； 抗性品系； 敏感品系； 代谢酶； 基因表达差异
中图分类号：S666 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0022-06
柑橘全爪螨Panonychus citri （McGregor）又名柑橘红蜘蛛，属蜘蛛纲蜱螨目叶螨科，是一种世界广泛分布的重要害螨。柑橘全爪螨主要吸食柑橘叶片、嫩梢、花蕾和果实汁液，严重时引起落叶、落花、落果，造成减产。化学防治仍是控制柑橘全爪螨最有效的措施，但由于其个体小、世代多、繁殖力强，对药剂极易产生抗性。目前，柑橘全爪螨已对大多数登记的有机磷、菊酯类杀螨剂产生了抗性[1-4]，专用杀螨剂抗性也极其突出[5-6]。噻螨酮属噻唑烷酮类低毒选择性专用杀螨剂，对柑橘全爪螨卵、幼螨、若螨活性极强，是低温下防治柑橘全爪螨的理想产品，在许多柑橘主产国广泛应用[7-8]。由于施用不当，柑橘全爪螨对噻螨酮已产生严重的抗性[9]，因而有必要建立其科学的抗性治理策略。弄清抗性机理是进行抗性治理的基础。
水解酶和保护酶活性增强是昆虫（螨类）对杀虫（螨）剂产生抗性的重要机制[10-11]，而基因的上调是3种代谢酶活性增强最直接的原因，因此，弄清代谢抗性相关基因表达差异是深入研究昆虫（螨类）抗性分子机理的重要途径。鉴于此，笔者通过室内选育，获得了柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系，进一步探讨了抗性和敏感品系之间谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因、羧酸酯酶（CarE）基因，过氧化氢酶（CAT）基因的表达差异，旨在弄清柑柑橘全爪螨抗性与3种代谢抗性相关基因表达差异的关系，从而明确柑橘全爪螨抗性产生可能的分子机理，为抗性治理提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
供试虫源：柑橘全爪螨于2005年采自中国农业科学院柑桔研究所多年未施用药剂的柠檬上，后经室内不接触药剂连续饲养至今，视为相对敏感品系。柑橘全爪螨饲养温度为（25±1） ℃、相对湿度为70% ～80%，光周期L∶D =14 h∶10 h。
供试药剂：50 g·L-1噻螨酮（hexythiazox）乳油，日本曹达株式会社生产。
1.2 柑橘全爪螨的生物测定
采用联合国粮农组织推荐的玻片浸渍法[12]。在预备试验的基础上，在柑橘全爪螨雌成螨死亡率20%～90%内按等比级数将供试药剂分别配成5～7个浓度，现配现用。处理时将双面胶带剪成3 cm长贴在载玻片的一端，用细毛笔挑起健康雌成螨，背部贴在胶带上，每块载玻片60头，每处理重复5次，共300头。将载玻片分别浸入药液，轻轻摇动5 s后取出，用吸水纸吸净螨体多余的药液，在室温下晾干，15 min后放入光照培养箱（温度（25±1） ℃，相对湿度为70%～80%，光周期L∶D =14∶10），24 h后在双筒解剖镜下分别观察死、活螨数，以清水处理为对照。
1.3 柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系选育
柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系从敏感品系选育而来。测定敏感品系（F0）对噻螨酮的敏感基线，然后以杀死品系70%～90%的噻螨酮浓度处理成螨，记录存活数量，存活个体继续饲养和药剂汰选，选择压力相近，每隔2代测定1次LC50（方法同1.2），观察抗性增长速度。
1.4 柑橘全爪螨代谢抗性相关基因差异性分析
谷胱甘肽S-转移酶（GST）、羧酸酯酶（CarE）、过氧化氢酶（CAT）的基因信息从本课题组柑橘全爪螨转录组数据库获得[13]。基因表达谱文库构建参照Wang等[14]的方法 ，采用TRIzol试剂盒分别提取柑橘全爪螨噻螨酮抗/敏品系约10 μg总RNA，经质量分析合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入fragmentation buffer使其成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，分别合成cDNA第1链和第2链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A和测序接头，回收目的大小片段，并进行PCR扩增，完成整个文库制备工作，构建好的文库用Illumina HiSeqTM 2000进行测序。测序仪产生的原始图像数据经base calling转化为序列数据，去除杂质后得到clean reads，使用短reads比对软件SOAPaligner/soap[15]将clean reads分别比对到参考基因组和参考基因序列，利用唯一比对上基因的reads数目和比对上参考序列的总reads数来计算基因表达量（reads per kb per million reads， RPKM）[16]，其公式为：
设RPKM（A）为基因A的表达量，则C为唯一比对到基因A的reads数，N为唯一比对到参考基因的总reads数，L为基因A的碱基数。RPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异。
1.5 柑橘全爪螨不同品系CAT基因定量分析
采用实时荧光定量PCR 方法测定柑橘全爪螨抗性和敏感品系CAT 基因的相对表达量。应用Primer5.0软件设计引物，前引物为：GTACCTTTTCCGTTGATGGTTC，后引物为：GTGGCCTTTGAAACACTTTCC，以ELF1A[17]为内参基因，在Bio-Rad icycler iQ分析系统上进行操作，反应条件如下：95 ℃预变性30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 个循环。实验重复3 次。反应结束后收集Ct 值，基因的相对表达量采用2-C法[18]进行计算。
1.6 数据统计与分析
应用Abbott公式计算校正死亡率。所得数据用SAS（6.12）统计软件计算毒力回归方程，致死中浓度LC50及其95%置信度以及相关系数等参数，采用卡方（χ2）检验毒力回归方程真实性。
2 结果与分析
2.1 柑橘全爪螨对噻螨酮的抗性选育
柑橘全爪螨抗性选育结果见图1。以70%～90%的死亡率作为选择压力，经过20代抗性选育，LC50由选育前的0.05 mg·L-1上升到197.79 mg·L-1，抗性倍数达3 532.12，柑橘全爪螨对噻螨酮抗性发展总体上非常迅速。前4代、第7代至第12代、第19代至第20代抗性发展相对较慢，而抗性发展较迅速的主要有2个阶段，第1阶段为第5代至第6代，第2阶段为第13代至第18代。第20代后的抗性发展状况还需进一步观察和研究。
2.2 柑橘全爪螨GST基因表达差异分析
通过BLAST搜索比对，从柑橘全爪螨转录组中鉴定出25条相似度较高的GST基因（E-value， le-5，下同）（表1），通过进一步差异性分析发现，抗性品系中有11条GST基因表达上调，14条GST基因表达下调，其中Unigene31530上调倍数最高[log2 ratio （RS/SS）为1.05]，Unigene18331下调倍数最高[log2 ratio（RS/SS）为-10.37]，其他GST基因上调或下调的倍数介于[-2
2.3 柑橘全爪螨羧酸酯酶基因表达差异分析
对鉴定出的39条相似度较高的CarE基因进行差异性分析（表2），抗性品系中有17条CarE基因表达上调，22条CarE基因表达下调，下调基因数多于上调基因数，其中Unigene23121上调倍数最高[log2 ratio （RS/SS）为2.05]，Unigene30172下调倍数最高[log2 ratio（RS/SS）为-11.52]，其次为Unigene9042[log2 ratio（RS/SS）为-9.72]，其他CarE基因上调或下调的倍数相对较低[-3
2.4 柑橘全爪螨过CAT基因表达差异分析
对鉴定出的9条相似度较高的CAT基因进行差异性分析（表3），抗性品系中有6条表达上调，3条表达下调，上调基因数明显多于下调基因数，其中U（nigene31477上调倍数最高[log2 ratio （RS/SS）达到了10.04]，Unigene9876下调倍数最高[log2 ratio（RS/SS）为-0.56]，其他过氧化氢酶基因上调或下调的倍数介于[-0.38≤log2 Ratio（RS/SS） ≤1.05]。进一步对Unigene31477进行荧光定量PCR分析发现，抗性品系和敏感品系基因表达水平没有显著差异（图2）。
3 讨 论
噻螨酮由于对叶螨卵和若螨具有特殊防效而被广泛用于柑橘全爪螨的防治，但由于长期单一使用，柑橘全爪螨极易对其产生抗性。在日本，连续使用6年的果园，LC50 由25 mg·L-1上升至 9 000 mg·L-1；研究者在田间进一步通过对相对敏感品系施用噻螨酮连续17 次筛选，再经室内连续6 代筛选后，柑橘全爪螨抗性倍数高达到23 000倍[19-20]。本研究使用噻螨酮对橘全爪螨进行20代抗性选育，LC50由选育前的0.05 mg·L-1上升到197.79 mg·L-1，抗性倍数达3532.12，抗性发展极其迅速，达到了极高水平抗性。鉴于此，柑橘全爪螨防治过程中必须高度重视其抗药性，生产上可选用其他作用机制不同的杀螨剂与之轮用，以控制噻螨酮年使用次数。
已有的生化机理研究表明，柑橘全爪螨对专用杀螨的抗性可能与GST和CarE活性增强有关。陈达荣等[1]报道了柑橘全爪螨体内CarE的活性与有机磷类药剂的抗性呈正相关。陈年春等[2]研究发现GST解毒活性的增强可能是柑橘全爪螨对水胺硫磷产生抗性的主导机制，CarE代谢能力的增强可能是柑橘全爪螨对甲氰菊酯产生抗性的重要原因。孟和生等[21]研究发现，柑橘全爪螨体内GST活性的提高是其对哒螨灵产生抗性的重要原因。Ran等[22]通过研究发现，柑橘全爪螨对噻螨酮的抗性与体内CarE的活力增加有关。Niu等[23]报道GST活性与柑橘全爪螨不同田间种群药剂敏感性有一定关系。本研究通过分析柑橘全爪螨敏感品系和噻螨酮抗药品系GST和CarE基因表达差异发现，抗药品系中有11条GST基因和17条CarE基因表达上调，但GST基因和CarE基因上调倍数均不太高，可能与柑橘全爪螨对噻螨酮的抗性关系不太密切。
CAT、SOD和POD在昆虫体内的主要功能是通过协调作用清除自由基，防御活性氧或其它过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害。目前已有资料报道保护酶系统活性增强可能与赤拟谷盗和剌蛾等昆虫的抗药性有关[11，24]。本研究对柑橘全爪螨数字基因表达谱比较分析发现，噻螨酮抗性品系中CAT基因（Unigene31477）上调倍数极高，但进一步定量PCR分析发现，抗性和敏感品系Unigene31477表达水平并不存在显著差异，2种分析方法出现的结果差异主要是由于高通量测序过程中较高的RDR引起。根据Unigene31477定量分析结果推断，CAT基因与柑橘全爪螨对噻螨酮的抗性同样关系不太密切。
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