分光光度法测定茶叶中茶多酚实验条件摸索
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【摘 要】（Tea Polyphenols）是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中以黄烷醇类物质（儿茶素）最为重要。茶多酚又称茶鞣或茶单宁，是形成茶叶色香味的主要成份之一，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一。
【关键词】茶多酚；分光光度法；实验条件摸索
光学分析法是利用物质对光产生吸收，根据吸收的特征和吸收程度对物质进行定性和定量的分析方法。
许多物质的溶液是有颜色的。例如高锰酸钾溶液呈紫色，邻二氮菲亚铁络合物的溶液呈橙红色，亚硝酸盐先重氧化再偶合生成紫红色染料等等。溶液的浓度越大，颜色越深。目视比色法就是基于物质溶液颜色的深浅来测定物质浓度的一种方法，在目视比色法的基础上又发展了光电比色法和分光光度法等。在选定波长下，分光光度法是建立在被测物质的溶液浓度对光吸收程度与溶液中吸光组分的浓度有定量关系。通常是将被测物质通过化学反应转变成有色化合物和络合物，然后根据颜色的深浅来定量。分光光度法具有如下特点：
1、灵敏度高：常用于测定式样中1%～3%的微量组成，如组分经富集，灵敏度可提高2～3个数量级。2、准确度高：响度误差约为5%～10%，准确度能够满足量组分测定的要求。3、操作简单：所需设备不复杂，如果将式样处理成溶液，通常只需经历显色和测量就可得出结果。4、应用广泛：几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或者间接测定。是应用最广泛的一种分析法。
一、实验前的准备
1、茶叶的取样。小包装茶取样时，在整批包装完成后的堆垛中，从不同堆放位置随机抽取规定的件数，逐件开启。从各件内不同位置处，取出2～3盒（听、袋）。所取样品保留数盒（听、袋），盛于密闭的容器中，供单个分别检验。其余部分现场拆封，倒出茶叶，混匀。再用分样器或四分法逐步缩分至约500g，作为平均样品，装于茶筒中，供检验用。袋泡茶的拆封混样工作，在检验室内进行。
2、试样的制备
样品、花茶、仪器、研钵
操作步骤：将茶样按茶取样方法取出，置于研钵中磨碎，达到实验所需粒度。
原理：用沸水萃取茶叶中的可溶性物质，再经过滤，留滤液配成试液。
仪器：烧杯（500mL、250mL）玻璃棒、量筒、漏斗、试纸、锥形瓶
操作步骤：准确称取3g（精确至0.0001g），磨碎的试样于500mL烧杯中，加沸蒸馏水450mL，放在电热板上加热45min（每隔10min用玻璃棒搅拌一次）。煮完后，用普通过滤进行过滤，过滤完再洗2-3次为止，将滤液稀释至500mL即可。
二、分光光度计的使用方法
721型分光光度计其波长范围360～800nm，色散元件为三角棱形。使用之前先检查仪器各调节钮的起始位置是否正确，接通电源开关，打开样品室暗箱盖，使电表指针处于“0”位，预热20min后，再选择须用的单色光波长和相应的放大灵敏度档，用调“0”电位器调整电表为T=0%。
盖上样品室盖使光电管受光，推动试样架拉手，使参比溶液池（溶液装入4/5高度，置第一格）置于光路上，调节100%透射比调节器，使电表指针指T=100%。重复进行打开样品室盖，调0，盖上样品室盖，调透射比为100%的操作至仪器稳定。盖上样品室盖，推动试样架拉手，使样品溶液池置于光路上，读出吸光度值。读数后应立即打开样品室盖。
测量完毕，取出比色皿，洗净后倒置于滤纸上晾干。各旋钮置于原来位置，电源开关置于“关”，拔下电源插头。
放大器各档的灵敏度为：“l”×1倍；“2”×10倍；“3”×20倍，灵敏度依次增大。由于单色光波长不同时，光能量不同，需选不同的灵敏度档。选择原则是在能使参比溶液调到T=100%处时，尽量使用灵敏度较低的档，以提高仪器的稳定性。改变灵敏度档后，应重新调“0”和“100”。
原理：分光光度法利用物质对某种波长单色光能量的吸收特性，根据朗伯―比耳定律以测量物质的成分和含量。本仪器是利用相对测量原理工作。既先选定某一溶剂作为空白溶液（或参比溶液）将某透过率（透射比）依为100%（或吸光度、浓度为0），然后测定式样的透过率（或吸光度、浓度）读取相对比值。
T=I0/I A=LgI0/I=Lg1/T=abc 其中，T――投射比 a――吸收系数 I0――入射光强度 b――溶液的光程强度 I――投射光 c――溶液的浓度 A――吸光度
由上述可以看出当吸光系数与光程长度不变时，吸光度与溶液的浓度成正比。
三、分光光度法测定茶叶中茶多酚
1、实验所用试剂和仪器
仪器：电子天平、分光光度计、酸度计、烧杯、锥形瓶、量筒、试剂瓶、 漏斗移液管、比色皿
试剂：酒石酸亚铁溶液、pH=7.5磷酸盐缓冲液、1/15M磷酸氢钠、 1/15M磷酸二氢钾蒸馏水
2、溶液的配制
酒石酸亚铁溶液：称取0.5g（准确至0.0001g）、硫酸亚铁和2.5g （准确至 0.0001g）、酒石酸钾钠，用水溶解并定容至500mL（溶液应避光，低温保存，有效期一个月）。
pH=7.5磷酸盐缓冲液：1/15M磷酸氢二钠：称取11.6885g磷酸氢二钠，加水溶解后定容至500mL。1/15M磷酸二氢钾：称取4.539g磷酸二氢钾，加水溶解后定容至500mL。
取上述1/15M的磷酸氢二钠溶液85ml和1/15M的磷酸二氢钾溶液15ml混合均匀。
3、测定
（1）试液的制备：按制备方法制备试液。
（2）测定：准确吸取制备好的试液1mL，注入25mL的容量瓶中，加水4mL和酒石酸亚铁溶液5mL，充分混合，再加缓冲溶液液稀释至刻度，用10mm比色杯，在波长540nm处，以试剂空白溶液（空白即在不加试液换为蒸馏水配成的溶液）作参比，测定吸光度（A）。
（3）结果计算
茶叶中茶多酚的含量，以干态质量百分率表示，按下式计算：
茶多酚（%）= ×100
式中，L1――试液的总量， mL L2――测定时的用液量， mL M――试样的质量， g
m――试样干物质含量百分率，% A――试样的吸光度
通过本验证实验可知，放置时间对茶叶中茶多酚含量也有影响，放置时间越长，茶多酚的含量越低，因此，后面的实验应该用新配的试液。
综上所述，分光光度法测定茶叶中茶多酚最佳实验条件为：pH在7.0左右， 显色剂酒石酸亚铁的用量为4mL，试验温度为95℃，供试液为新配制。
【参考文献】
[1]陈培榕，邓勃.现代仪器分析实验与技术[M].北京：清华大学出版社，2004.
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