鼠尾草酚抗乳腺癌细胞增殖活性及其雌激素受体亚型介导和调节机制的研究
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[摘要]既往研究已经表明，鼠尾草酚（carnosol）具有一定的抗乳腺癌效应，但其ER亚型特异性调节和介导机制与该物质抑制细胞增殖效应的相关性尚不清楚。该研究利用雌激素受体（ER）阳性乳腺癌T47D细胞观察鼠尾草酚对细胞增殖活性的影响及其雌激素受体α，β亚型特异性介导和调节机制。以ERα和ERβ特异性拮抗剂MPP，PHTPP为工具药，采用MTT细胞增殖实验观察鼠尾草酚对T47D细胞增殖的影响；检测T47D细胞增殖周期的变化。利用Western blot方法检测鼠尾草酚对T47D细胞ERα和ERβ表达情况的影响。研究发现，1×10-5～1×10-7 mol・L-1鼠尾草酚能够显著抑制T47D细胞增殖，该抑制作用可被ERα拮抗剂MPP增强、被ERβ拮抗剂PHTPP减弱；1×10-5，1×10-6 mol・L-1鼠尾草酚可使T47D细胞增殖指数显著下降。Western blot检测结果显示1×10-5，1×10-6 mol・L-1鼠尾草酚可使T47D细胞ERα和ERβ蛋白表达显著增加，并可明显提高ERα/ERβ。结果表明鼠尾草酚具有抑制ER阳性乳腺癌细胞增殖的作用，其效应是通过靶细胞雌激素受体，特别是ERβ途径实现的；同时，鼠尾草酚对靶细胞雌激素受体ERα和ERβ亚型的表达及其比例具有调节功能。
[关键词]鼠尾草酚；乳腺癌；T47D细胞；细胞增殖；细胞周期；雌激素受体
迷迭香Rosmarinus officinalis L系唇形科迷迭香属植物，长期以来在抗氧化、抗炎、抗癌作用等方面均有较为深入的研究和广泛的应用[1]。近年来的研究发现，迷迭香提取物及迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚（图1）等成分具有抗肿瘤如肺癌[2]、前列腺癌[3]、结肠癌[4]、卵巢癌[5]、乳腺癌[6]，防止致癌物质在体内的代谢活化[7]、抗血管生成等作用[8]，引起了人们广泛的关注[9]。另有报道也发现迷迭香主要抗氧化成分鼠尾草酚对扩散性大鼠乳腺癌F3II细胞和人乳腺癌MCF-7细胞均具有增殖抑制活性，且具有良好的选择性，是值得开发的乳腺癌抑制剂[10]。而乳腺癌细胞中ER亚型的数量及其比例是影响ER阳性细胞增殖活性的重要因素，本实验室在既往研究中也已经发现[11]：对ER阳性乳腺癌细胞生长具有明显抑制效应的丹参酮ⅡA就是通过ER途径发挥作用的。本研究拟以ERα和ERβ双阳性乳腺癌T47D细胞为实验材料，对鼠尾草酚抑制乳腺癌细胞生长的效应与其ER亚型特异性介导和调节功能及其相关性进行分析，进一步深入揭示鼠尾草酚抗乳腺癌作用的靶点和机制。
1 材料
1.1 试剂 DMEM（高糖）、无酚红DMEM（高糖）、胎牛血清、活性炭-葡聚糖苷处理的胎牛血清（CDT-FBS）为Hyclone公司产品；雌二醇（estradiol，E2），MTT，DMSO，RNase，碘化丙啶（propidium iodide，PI），氯仿，甲醇为Sigma公司产品；ERα，ERβ抗体为Santa Cruz公司产品；ERα，ERβ特异性拮抗剂MPP，PHTPP为Tocris公司产品；甘氨酸、Tween-20为Amresco公司产品；BCA蛋白定量试剂盒，RIPA裂解液，苯甲基磺酰氟（PMSF），30%丙烯酰胺，浓缩胶缓冲液，分离胶缓冲液，蛋白相对分子质量Marker，三羟甲基氨基甲烷，十二烷基磺酸钠，脱脂奶粉，TEMED，SDS-PAGE 上样缓冲液，ECL超敏发光液为普利莱基因有限公司产品；二抗Anti-Rabbit IgG/HRP和Anti-Goat IgG/HRP为北京康为世纪生物科技有限公司产品；甲醇为北京化工厂产品。
1.2 药物与细胞株 鼠尾草酚在哈佛大学附属Mclean医院天然产物分析实验室提取并进行化学结构鉴定：迷迭香干燥叶100 g磨成粉状，室温丙酮提取3次，提取物减压蒸发后得到的残留物再经二氯甲烷/甲醇梯度硅胶色谱得到鼠尾草酚12 mg，其化学结构经HPLC鉴定，并与NMR数据进行对比验证，确定所提取化合物为鼠尾草酚，且纯度>98%。实验时以DMSO溶解，终浓度为1×10-5 ～1×10-7 mol・L-1。人乳腺癌T47D细胞购自北京协和医学院细胞中心。
1.3 仪器 CO2培养箱（Binder）；酶联免疫检测仪（Epson LX-800）；倒置显微镜（Olympus）；凝胶成像分析仪（Pharmacia）；流式细胞仪。
2 方法
2.1 细胞培养 人乳腺癌T47D细胞，常规培养在含10%胎牛血清的DMEM高糖溶液中，培养条件为37 ℃，5%CO2，相对饱和湿度。实验开始前4 d将细胞用PBS洗涤2次后，改为在无酚红DMEM（含5%CDT-FBS）中培养，以耗尽细胞内储存的雌激素。
2.2 MTT细胞增殖试验 T47D细胞传代3次，经无酚红DMEM（含5%CDT-FBS）培养4 d后，选取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次，加入无血清DMEM，以3×103个/孔的细胞密度接种于96孔板内，每孔培养液总体积为200 μL。培养24 h待细胞贴壁后，换为含1×10-8 mol・L-1 雌二醇、1×10-5～1×10-7 mol・L-1鼠尾草酚的DMEM培养液中继续培养；在拮抗组中同时加入1×10-8 mol・L-1 MPP或PHTPP；每种受试物均设6个复孔。于48 h后加入MTT（5 g・L-1，15 μL/孔），继续孵育4 h，小心吸去培养液，每孔加入DMSO 150 μL。以DMSO调零，用酶联免疫检测仪在570 nm下测定各孔吸光度（A），计算平均A和增殖率（proliferation rate， PR）。
PR =A实验组/A溶剂对照组×100%
2.3 细胞周期测定 取经无酚红DMEM（含5%CDT-FBS）培养4 d的T47D细胞，以5×105个/瓶的密度接种于25 cm2的培养瓶中，以无血清DMEM接种24 h待细胞贴壁后，换为含1×10-8 mol・L-1 雌二醇、1×10-5 mol・L-1或1×10-6 mol・L-1鼠尾草酚的DMEM培养液继续培养。48 h后终止培养，收获细胞用70%冷乙醇4 ℃固定过夜，RNase处理，PI染色，2 h内用流式细胞仪检测细胞周期分布，并计算细胞增殖指数（proliferation index，PI）。
PI =（S+G2M ）/（G0/G1+S+G2M）×100%
2.4 Western blot检测细胞ERα，ERβ蛋白表达 细胞预处理过程同2.3。药物作用48 h后，收集细胞，加入细胞裂解液并以14 000×g离心20 min，将上清部分进行蛋白含量测定后用于免疫印迹分析。蛋白变性后上样，SDS-PAGE电泳（浓缩胶80 V，分离胶120 V），半干电转膜仪转膜（60 V，120 min）。5%脱脂奶粉37 ℃振摇1 h将膜封闭；加入一抗，4 ℃孵育过夜。HRP标记的二抗37 ℃振摇1 h后，将PVDF膜置ECL混合液中室温下振荡孵育5 min，X胶片曝光，显影、定影、扫描后，以β肌动蛋白表达量为对照观察结果。
2.5 数据统计与分析 实验结果均用±s表示，用SPSS 11.0软件进行数据处理，用t检验进行统计学分析。
3 结果
3.1 MTT细胞增殖试验检测鼠尾草酚对T47D细胞增殖的抑制效应及MPP，PHTPP的干预作用 1×10-8 mol・L-1雌二醇在48 h可使T47D细胞增殖速率明显增加（P
3.2 鼠尾草酚对T47D细胞增殖指数的抑制效应 选取上述增殖实验中效应较为显著的48 h作为检测时间点，1×10-8 mol・L-1雌二醇对T47D细胞增殖指数有明显升高作用（P
3.3 Western blot检测鼠尾草酚对T47D细胞ERα和ERβ蛋白表达的影响 在作用48 h后，雌二醇可使T47D细胞ERα和ERβ蛋白表达水平显著升高（P
4 讨论
已有研究证实鼠尾草酚可以明显抑制MCF-7细胞增殖[12]。然而值得注意的是，MCF-7细胞虽是ER阳性细胞，但该细胞ERα表达占明显优势[13]。而ERβ也是一种在体内有广泛分布，在雌激素样效应产生过程中有重要作用的受体亚型，而且与ERα在所介导功能与效应上也存在差异。同时，作者在以前的研究中曾发现：补骨脂素、异补骨脂素、槲皮素等中药活性成分均可通过ER途径或ER亚型调节功能发挥对乳腺癌细胞增殖的干预作用[14-16]。因此，本研究选取了ERα，ERβ双阳性且两者表达程度较为相近的T47D细胞为实验材料，深入探讨鼠尾草酚抗乳腺癌效应的ER亚型特异性介导机制，观察其对2种ER亚型表达情况和比例的调节作用及其与该物质抑制细胞增殖效应的相关性，以期为更加全面和深入地揭示鼠尾草酚抗乳腺癌作用的分子机制提供实验依据。
实验结果显示：鼠尾草酚具有明显的抑制乳腺癌T47D细胞增殖的作用，并使细胞增殖指数显著降低。值得注意的是，在T47D细胞增殖实验体系中加入ERα特异性拮抗剂后，鼠尾草酚抑制T47D细胞增殖的作用明显增强；加入ERβ特异性拮抗剂后，鼠尾草酚抑制T47D细胞增殖的作用明显减弱。这不仅证明在ER阳性细胞中，作用于ER是鼠尾草酚发挥增殖抑制作用的重要靶点和途径之一，也说明在介导鼠尾草酚发挥抗乳腺癌细胞增殖作用的过程中，ERβ起着更加关键的作用，即鼠尾草酚更主要地是通过ERβ途径介导其抗乳腺癌效应的。
Johnson等在利用MCF7细胞进行的实验研究中发现，鼠尾草酚具有抑制MCF7细胞ERα表达的效应；但在本次应用乳腺癌T47D细胞进行的实验中，蛋白印迹测定结果显示鼠尾草酚能够增加T47D细胞ERα和ERβ的表达；相对而言，雌二醇虽也具有增加ERα和ERβ表达的效应，但对二者的增加幅度相近，即对二者表达比例无显著影响；而鼠尾草酚对ERα的升高效应比ERβ显著，即鼠尾草酚不但可分别显著上调ERα和ERβ表达水平，而且具有升高ERα/ERβ的作用。这与作者在之前的报道：丹参酮IIA对T47D细胞ER亚型比例的影响趋势一致[11]。另据已有文献报道，在介导转录活性方面，ERα比ERβ在激活基因转录上作用显著，而ERβ在抑制基因转录上比ERα作用更强[17-18]。因此，在细胞增殖实验中分别加入ERα或ERβ特异性拮抗剂将依次分别使鼠尾草酚抑制T47D细胞增殖的作用被增强或减弱。但从蛋白印迹实验结果可以看出：由于鼠尾草酚具有ERα和ERβ受体表达调控作用，即改变ERα，ERβ自身表达水平和比例，特别是可以升高ERα/ERβ，这将部分减弱鼠尾草酚的抗乳腺癌细胞增殖效应。因此，上述结果一方面说明了鼠尾草酚可调控T47D细胞ERα/ERβ，即具有特异性雌激素受体亚型活性调节功能，可以被称为选择性雌激素受体调节剂（selective estrogen receptor modulator，SERM）；另一方面，因为ERα，ERβ双阳性细胞内ER亚型间的比例是影响药物调控细胞增殖作用的重要条件和依据，实验结果也为临床乳腺癌治疗方案的选择提供和补充了必要的实验依据，结果提示如果将鼠尾草酚与ERα拮抗剂联合应用，可进一步使细胞ERβ水平相对显著升高、增强药物的抗乳腺癌活性，这也将为今后更加深入的相关实验探索和研究，特别是为药物的临床应用提供重要参考和新的思路。
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Effect of carnosol against proliferative activity of breast cancer cells and its
estrogen receptor subtype′s mediation and regulation mechanisms
ZHAO Pi-wen1， 2， David Yue-Wei LEE2， Zhong-ze MA 2， SUN Yan-ling1，
TAO Shi-ying1， ZANG Jin-feng 1， NIU Jian-zhao1*
（1. School of Preclinical Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；
2. Mclean Hospital， Harvard Medical School， Belmont MA 02478， USA）
[Abstract]Carnosol has been proved to have anti-breast cancer effect in previous research. But its ER subtype′s specific regulation and mediation mechanisms remain unclear. The aim of this study is to observe the effect of carnosol on cell proliferation and its estrogen receptor α and β′s specific regulation and mediation mechanisms with ER positive breast cancer T47D cell. With estrogen receptor α and β antagonists MPP and PHTPP as tools， the MTT cell proliferation assay was performed to observe the effect of carnosol on T47D cell proliferation. The changes in the T47D cell proliferation cycle were detected by flow cytometry. The effect of carnosol on ERα and ERβ expressions of T47D cells was measured by Western blot. The findings showed that 1×10-5-1×10-7 mol・L-1 carnosol could significantly inhibit the T47D cell proliferation， which could be enhanced by MPP or weakened by PHTPP. Meanwhile， 1×10-5 mol・L-1 or 1×10-6 mol・L-1 carnosol could significantly increase ERα and ERβ expressions of T47D cells， and remarkably increase ERα/ERβ ratio. The results showed that carnosol showed the inhibitory effect on the proliferation of ER positive breast cancer cells through target cell ER， especially ERβ pathway. In the meantime， carnosol could regulate expressions and proportions of target cell ER subtype ERα and ERβ.
[Key words]carnosol； breast cancer； T47D cell； cell proliferation； cell cycle； estrogen receptor
doi：10.4268/cjcmm20141727