肝素寡糖对人外周血T细胞分泌白介素-4和白介素-5的影响
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摘要：目的研究肝素寡糖（Oligs）对人外周血T细胞（PBTLs）分泌白介素-4（IL-4）和白介素-5（IL-5）的抑制作用。方法用3种方法降解肝素并用凝胶过滤色谱法制备肝素寡糖。抽取10例过敏性嗜酸粒细胞性胃肠炎患者的PBTLs用植物凝集素（PHA）和Oligs处理，用ELISA法测定PBTLs培养的上清液分泌IL-4和IL-5的含量。 结果Oligs样品浓度5 μg/mL时，可显著抑制PBTLs对细胞因子IL-4、IL-5的分泌。但是，不同相对分子质量（Mr）的Oligs对IL-4和IL-5具有不同的作用。对IL-4抑制作用最强的是用过氧化氢降解肝素所得Mr为1 142的四糖。抑制IL-5作用最强的是用β-消除法降解肝素所得Mr为1 806的六糖。结论Oligs对人PBTLs分泌IL-4和IL-5的抑制作用与分子结构密切相关，并且有一个基本结构。对IL-4和IL-5抑制作用最强的分别是四糖和六糖。
关键词：肝素寡糖；人外周血T细胞；白介素-4；白介素-5
中图分类号：TQ464文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)11-0001-05
Effect of Heparin-Derived Oligosaccharides on Secretion of Interleukin-4 and Interleukin-5 from Human Peripheral Blood T Lymphocytes
JI Sheng-li1, ZHANG Yun-feng1, CUI Hui-fei1, SHI Feng1, CHI Yan-qing2, CAO Ji-chao1
(1. Institute of Biochemical and Biotechnological Drug, School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China; 2. Department of Pharmacy, Shandong Provincial Hospital, Jinan 250021, China)
Abstract：Objective To study the inhibitory effect of heparin-derived oligosaccharides (Oligs) on the secretion of IL-4 and IL-5 from human peripheral blood T lymphocytes (PBTLs). Methods Heparin was degraded by three different methods and low molecular weight heparins (LMWHs) were purified with gel-filtration chromatography in order to prepare Oligs. The PBTLs from ten patients with allergic eosinophilic gastroenteritis were treated with phytohemagglutinin (PHA) and Oligs, and the concentrations of IL-4 and IL-5 in the cell culture supernatant fluid were determined by ELISA. Results 5 μg/mL of Oligs samples could obviously inhibit the secretion of IL-4 and IL-5 from human PBTLs, while Oligs with different molecular weights（Mr）had different effects on the secretion of IL-4 and IL-5. A tetrasaccharide with Mr of 1 142 obtained by H2O2 degradation could most inhibit the secretion of IL-4, while a hexasaccharide with Mr of 1 806 obtained by beta-elimination could inhibit the secretion of IL-5 most. Conclusion The inhibitory effect of Oligs on the secretion of IL-4 and IL-5 from human PBTLs closely relates to their molecular structures and an essential structure exerts the inhibitory action. The most effective inhibitors on IL-4 and IL-5 secretion are tetrasaccharides and hexasaccharides, respectively.
Key words：heparin-derived oligosaccharides; human peripheral blood T lymphocytes; IL-4; IL-5
肝素是高度硫酸化的多聚阴离子糖胺聚糖，是由三硫酸双糖单位［-(IdoA2S)(14)-α-D- (GlcNS6S)-］聚合，兼有低硫酸化或多硫酸化的糖醛酸或氨基糖，平均相对分子质量（Mr）为12 000~15 000。肝素除有抗凝血作用外，还有抗炎作用，用于治疗溃疡性结肠炎和其它炎性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）[1,2]。尽管有许多文献报道了肝素的抗炎活性，但很少有文献报道肝素分子的特殊结构对白介素-4（IL-4）和白介素-5（IL-5）的抑制作用。在过敏性嗜酸粒细胞性胃肠炎患者中IL-4和IL-5异常与IgE升高和嗜酸性细胞增多密切相关。提示以作用于T细胞的治疗策略可有效地治疗此类疾病。我们现试图研究Oligs的结构和它与抑制过敏性嗜酸粒细胞性胃肠炎患者外周血T细胞（PBTLs）分泌 IL-4和IL-5的关系。为此，以来源于10例过敏性嗜酸粒细胞性胃肠炎患者的PBTLs作为研究对象。
1材料与方法
1.1材料
肝素钠（东营天东生化工业公司）；30 %过氧化氢（莱阳经济技术开发区精细化学品公司）；亚硝酸钠（济南化学试剂公司）；苯索氯铵和4-氯-苄基氯（Sigma）；Superdex-30（Amersham UK）；人IL-4和IL-5试剂盒（Bender Medsystem USA）；植物凝集素（PHA上海依华医学科技公司）；RPMI 1 640（Gibco UK）。
1.2方法
1.2.1Oligs制备分别用过氧化氢氧化降解法、亚硝酸脱氨基断裂法和碱性β-消除降解法降解肝素。将降解产物用凝胶过滤色谱分离得Oligs。所用色谱柱为Superdex-30（26 mm×1 200 mm）。Oligs用0.25 mol/L 碳酸氢铵洗脱，冻干即得。
1.2.2Oligs Mr的测定用分子排阻高效液相色谱（HPSEC）[3]法在两个串联的Ultrahydroge l 250 (7.8 mm×300 mm) 柱上测定Oligs的Mr，以国际低分子肝素Mr标准品（Mr＝3 700）作对照，用示差检测器和紫外检测器串联（UV接柱，RI接UV）进行双检测器检测，流动相为pH 5.0的28.4 g/L硫酸钠，流速 0.5 mL/min。
1.2.3T细胞分离和培养25 mL过敏性嗜酸粒细胞性胃肠炎患者的外周血用EDTA抗凝，与25 mL PBS液（含5 %胎牛血清）混合。混匀后将稀释的外周血轻轻铺在50 mL淋巴细胞分离液面上。室温2 000 r/min离心20 min，收集外周血淋巴细胞（PBL），并用PBS液洗涤2次，将细胞悬于RPMI-1 640（含20 %胎牛血清）培养基中，1.0 mL PBL混悬液上尼龙棉柱（5 mm×16 mm），平放尼龙棉柱，加入0.2 mL含20 %胎牛血清的RPMI-1640封口，平置于37 ℃温箱中保温30 min。用RPMI-1 640（含20 %胎牛血清）液洗脱PBTLs，离心30 min（2 000 r/min）。 用RPMI-1 640（含20 %胎牛血清）培养基稀释至1×106 个/mL。0.2 mL 细胞稀释液加到96孔培养板中作空白对照，另一孔加含20 μg PHA的细胞稀释液作为PHA对照组，其它孔加入 含20 μg PHA细胞稀释液和1.0 μL 1. 0mg/mL肝素及Oligs。细胞在37 ℃，5 % CO2温箱中保温48 h。
1.2.4细胞因子的测定室温下收集细胞液，1 000 r/min离心10 min。根据ELISA试剂盒的说明书测定上层液体的细胞因子量。
1.3统计学分析
数据以x±s表示，用t检验和单因素方差分析处理。P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1Oligs的分离及其Mr
肝素降解后用凝胶过滤色谱分离得Oligs，结果见图1。标有数字的峰用于IL-4和IL-5的分泌抑制实验，其Mr见表1。
H、B和N 分别代表肝素用过氧化氢氧化降解法、碱性β-消除降解法和亚硝酸脱氨基断裂法降解的产品，进一步用Superdex-30分子排阻色谱（26 mm×1 200 mm）分离，用0.25 mol/L碳酸氢铵溶液洗脱，流速0.5 mL/min，流出液用咔唑法检测。
2.2Oligs抑制IL-4分泌的结果
Oligs抑制IL-4分泌的实验结果见图2、图3。
I、II和III分别代表空白对照组、PHA对照组和肝素组。3~8分别是表1的各寡糖组。a P
抑制作用最强的是OligH-5(P＜0.05)，a P＜0.05 vs OligH-4 组
图3Oligs的相对分子质量及它与抑制IL-4的关系
由图2、图3可见，所有的Oligs对IL-4分泌都有抑制作用。不同制备方法得到的Oligs和不同Mr的Oligs具有不同的抑制活性。（1）来自于过氧化氢降解的具有最强抑制活性的寡糖为OligH-5（Mr 1 142），该寡糖片段是一种四糖，能使IL-4含量由375.6±39.2 pg/mL（PHA 对照组）减至 12.5±5.7 pg/mL（P＜0.01）；（2）来自于β-消除 降解具有最强抑制活性的寡糖为OligB-5（Mr 1 344），一种四糖，能使IL-4含量减至54.4±6.3 pg/mL（P＜0.01）；（3）来自于亚硝酸降解的具有最强抑制活性的寡糖为OligN-5（Mr 1 107），一种四糖，使IL-4含量减至47.4±5.8 pg/mL（P＜0.01）。尽管它们都是四糖，其Mr不同是因它们结构中所含的硫酸基含量不同。与肝素组的抑制活性相比（IL-4 含量为152.4±17.9 pg/mL），上述寡糖都明显强于肝素。
2.3Oligs抑制IL-5分泌的结果
Oligs抑制IL-5分泌的实验结果见图4、图5。
I、II和III分别代表空白对照组、PHA对照组和肝素组。3~8分别是表1中的各寡糖组。a P＜0.05， b P＜0.01 vs PHA 对照组，c P＜0.05 vs OligH-4组（n=10）。
抑制作用最强的是OligB-4(P＜0.05)， a P＜0.05 vs OligH-4 组
图5Oligs的相对分子质量及它与抑制IL-5的关系
由图4、图5可见，Oligs抑制IL-5分泌的作用趋势与IL-4相似，但也有不同之处。（1）来自于过氧化氢降解的具有最强抑制活性的寡糖为OligH-4（Mr 1 786）和OligH-5（Mr 1 142），分别使IL-5的含量由89.2±33.4 pg/mL（PHA对照组）减至31.7±5.6 pg/mL和35.5±4.4 pg/mL；（2）来自于β-消除降解具有最强抑制活性的寡糖为OligB-4（Mr 1 804），一种六糖，使IL-5含量减至22.0±5.2 pg/mL (P＜0.01)；（3）来自于亚硝酸降解的具有最强抑制活性的寡糖为OligN-4（Mr 1 747），一种六糖，使IL-5含量减至69.2±6.3 pg/mL（P＜0.01）。它们的抑制活性都比肝素组强（P＜0.01）（图4），其中最强的是OligB-4（图5）。
3讨论
过敏性嗜酸粒细胞性胃肠炎的典型特征是IgE水平升高，IgE通过介导肥大细胞的高亲和性Fc受体（FcεRI）交联在过敏性IBD中发挥重要作用，进而导致许多前炎症调节因子（包括组胺、白三烯、细胞因子）释放（图6）。临床研究报道嗜酸粒细胞性胃肠炎患者的PBTLs分泌IL-4和 IL-5增多。而且，来源于嗜酸粒细-胞性胃肠炎患者十二指肠固有层的T细胞在受乳蛋白刺激后，分泌以IL-4和IL-5为主的Th2细胞因子。IL-4可能在调节IgE依赖性过敏反应过程中起重要作用，因此，调节其产生或其作用可能在预防或者治疗急性超敏反应方面有用。IL-5对嗜酸粒细胞系特异性最强，并与嗜酸粒细胞选择性膨胀、从骨髓释放有关。嗜酸粒细胞颗粒包括一个主要碱性蛋白（MBP）组成的类晶体核和由嗜酸粒细胞阳离子蛋白（ECP）构成的基质[4]（图6）。这些阳离子蛋白质有共同的前炎症特性，但其他方面不同。MBP可以引发肥大细胞和嗜碱粒细胞脱颗粒。作为细胞因子、免疫球蛋白和补体的受体触发嗜酸粒细胞可以产生许多炎症因子，包括IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF、转化生长因子(TGF)、TNF-α、RANTES、巨噬细胞炎症蛋白1α、血管内皮细胞生长因子和嗜酸细胞活化趋化因子-1， 表明这些因子有能力调节免疫反应的多个方面。上述事实表明，调节IL-5的分泌和作用可能有助于预防治疗过敏综合征和炎症。
肝素除抗凝血和抗血栓外，还有其他生物活性如抑制补体激活、调节细胞增生、抑制新生血管生成和肿瘤生长以及抗病毒。在过去10年中，肝素和低分子肝素被广泛用于临床治疗IBD[5-8]。人们认为肝素能够治疗IBD的机制在于抑制中性粒细胞聚集[6]、减少前炎症细胞因子产生，恢复抗炎基因生长因子与其受体之间的高亲和性[2]。在IBD小鼠模型中也观察到肝素具有抑制中性粒细胞激活、黏附和趋化的作用，这意味着肥大细胞和中性粒细胞之间作用的平衡可能对IBD病程的发展非常重要。而且，未分级肝素具有潜在的免疫调节功能，因此，将未分级肝素用于常规方法治疗无效的大肠炎或者局限性肠炎等疾病是有根据的。肝素的抗炎作用很可能归功于它可与许多肝素结合蛋白（如TNF-α、IL-4、IL-5、RANTES、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂、中性粒细胞衍生的弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、嗜酸粒细胞衍生的MBP、L-选择素和P-选择素）[9]结合。此外，肝素还可特异性地抑制对一系列炎症细胞反应至关重要的三磷酸肌醇信号转导通路[10]。
当肝素用作抗炎药时，其出血副作用必须被有效控制。肝素的抗炎作用与其抗凝血作用无关[11，12]，尤其是用于治疗过敏性炎症时。用降解和部分脱硫酸基化等方法对肝素进行化学修饰的目的是获得肝素类衍生物的抗炎药。在此我们将肝素降解并用凝胶过滤色谱分离不同的片断，实验结果证明，这些寡糖片断用作抗炎剂具有发展前途[13]。我们还研究了肝素可能的抗炎机制（抑制IL-4和IL-5分泌），结果表明不同Mr的Oligs抑制IL-4和IL-5分泌的活性不同。抑制IL-4分泌活性最强的是四糖，但由于制备方法不同其Mr也不同，原因在于降解过程中脱硫酸基程度不同。在抑制IL-5分泌方面，亦有相同情况发生，不同的是活性最强的抑制因子是六糖，其原因有待进一步研究。
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