针刺对缓慢性心律失常大鼠心肌GiGs含量影响

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摘 要：目的：以蛋白印迹（Western blot）法测定电针治疗异搏定所致缓慢性心律失常大鼠心肌组织抑制性G蛋白（Gi）和激动性G蛋白（Gs）的含量，继而探讨针刺“内关”穴调节心律失常的效应机理。方法：用异搏定诱发大鼠缓慢性心律失常模型，成模后电针双侧“内关”穴。用MS2000多媒体生物信号记录分析系统记录心电图，观察针刺前后心率（律）变化；以蛋白印迹法测定大鼠心肌组织抑制性G蛋白（Gi）和激动性G蛋白（Gs）的含量。结果：电针治疗后，造模＋针刺“内关”穴组大鼠的心率（律）以及大鼠心肌组织中Gi、Gs含量与正常对照组的心率（律）以及Gi、Gs含量对比发生明显改变（P

关键词：内关；心律失常；G蛋白；Western blot

中图分类号：R2-03文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)05-1014-02

生物细胞几乎每时每刻都得依靠激素或神经递质等化学信使来互递通讯，以适应环境的变化，而大多数信使都是通过中介体来转导信息变化的。信使先与靶细胞外表面的特异受体结合而发出指令，把信息转发给一系列中介体，然后由其把指令传递给最后的执行者。G蛋白是鸟苷酸结合蛋白的简称，就是生物信息转导过程中关键的中介体[1]。针刺信息的传递也离不开这一信息转导途径。本项实验以心肌组织中G蛋白含量变化入手从细胞信号转导途径探讨针刺治疗缓慢性心律失常的机制。

1材料与方法

1．1实验动物与分组

健康成年Wistar大鼠45只，雄性，由辽宁中医药大学实验动物中心提供（Ⅰ级），体重（200±50）g。将大鼠随机分为5组，每组9只。A组：正常组，不做任何处理，只做空白对照；B组：异搏定模型组； C组：造模＋针刺“内关”穴组，即异搏定造模成功3min后，予针刺“内关”穴5min；D组：造模＋针刺“足三里”穴组，即异搏定造模成功3min后，予针刺“足三里”5min。E组：正常针刺对照组，即麻醉后直接针刺“内关”穴8min（相当于B、C、D组从造模开始到治疗结束的时间）。

1．2试剂与仪器

异搏定（批号：6E12003，购于辽宁中医药大学附属一院药局，上海禾丰制药有限公司）；MS2000多媒体生物信号记录分析系统（广州市龙飞达科技有限公司）；0.30mm×15mm毫针（苏州医疗用品厂有限公司）；电针仪(广东省汕头市医用设备厂，6805-A)；超低温冰箱（日本SANYO，MDF-382E）；抗体：Gs, Gi1/2/3（均购自美国Santa Cruz公司)；分光光度计（722－S）；电泳仪（DDY-6C）等。

1．3动物模型的制备

以20％氨基甲酸乙酯（5mL/kg）进行大鼠腹腔注射麻醉，后于舌下静脉注射异搏定(5mg/kg),以心电图出现心动过缓和房室传导阻滞等心律失常波形为成模标志[2]。

1．4心率测定方法

大鼠麻醉后，仰卧固定于自制鼠台上，选用MS2000多媒体生物信号记录分析系统，按人体标准导联的方法连接，将针状电极插入大鼠四肢末端及剑突皮下，分别记录各组造模前后和C、D、E组针刺后心电图，取连续10个心电周期计算平均值做为实验大鼠的心率（表1）。

1．5电针方法及取材

根据《实验针灸学》[3]大鼠穴位图谱取“内关”穴（腕横纹中点上3mm）和“足三里”穴（胫骨粗隆下外2mm）。用0.5寸毫针直刺2～3mm。在成模3min时行针刺，C组E组取双侧“内关”穴，直刺2～3mm；D组取“足三里”穴，直刺5～8mm，加电针，用疏密波（疏密交替持续的时间各约1.5s，频率疏波为2Hz，密波40Hz），强度以大鼠肢体微微颤动为宜，针刺5min，记录心电图。于腹主动脉取血约5mL后立即开胸取出心脏，置于0℃PBS液中去除余血，迅速取50mg左心室心肌组织放入经DEPC水处理过的EP管中，于－20℃冷冻备用。取材均在大鼠尚未恢复正常心律期间（A组麻醉后随时取；B组在成模后8min时取材；C、D、 E组均在针刺后马上取材）。

1．6蛋白含量测定

选用蛋白印迹（Western blot）法测定。

1．6．1浆膜蛋白制备将冷冻心肌组织组织置于4℃预冷的含0.4mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF），1mmol/L1.10-二氮杂菲（Phenanthroline），1mmol/L碘代乙酰胺（Iodoacetamide）和1μmol/L蛋白酶抑制剂（Pepstatin）A的pH7.0的匀浆缓冲液1mL中，冰浴下剪碎、匀浆，离心15min，分离浆、膜蛋白取上清液离心（12000r/min） 25min。膜蛋白洗涤一次，浆、膜蛋白均存于-70℃备用。离心均在4℃进行。

1．6．2电泳将制备的浆、膜蛋白样品用改良的福林酚法定量，牛血清白蛋白为标准。按1:1加入样品缓冲液，终浓度为2g/L，100℃处理3min，离心30s。用11%聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳。

1．6．3电转印将胶及硝酸纤维素膜(Ncm)夹于两张滤纸之间,放入已装有电转液的电转移槽，电压15V，转印10h后取出,将转移后的凝胶染色，检查转印是否完全,然后将Ncm仔细做好标记。

1．6．4杂交将做好标记的Ncm置于含脱脂奶粉的pH7.2的PBS中封闭5h，PBS漂洗1次×15min，2次×5min后加入抗G蛋白抗体，室温反应1h后，将Ncm用PBS清洗1次×5min，2次×5min后置于辣根过氧化物酶标记的IgG中反应40～60min，PBS洗1次×15min，4次×5min后待检测。抗体稀释均用含3%牛血清白蛋白的pH7.2的PBS液。

1．6．5显色以碱性磷酸酶AP作为的显色交联酶，加入显色液20～30min，显示Western blot的结果。

1．6．6Western杂交分析将硝酸纤维素膜置于图像扫描仪下，对目标带进行密度分析，结果用灰阶×面积表示。校正上样量根据同时进行的电泳复本胶染色干燥后形成影像的密度进行校正。

1．7统计学方法

实验结果大鼠的心率（律）以及Gi、Gs含量用均值±标准差（±s）表示，用SPSS10.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析F检验。

2结果

2．1对缓慢性心律失常模型大鼠的观察

经舌下静脉注射异搏定后即出现心动过缓和房室传导阻滞等心律失常波形，持续时间18min左右。与文献报道一致[2]。

2．2针刺对缓慢性心律失常大鼠心率（律）及心肌组织gigs的影响结果（见表1～2）

2．2．1心率变化从表1可以看出，C组造模后心率明显比造模前减慢，治疗后心率逐渐恢复正常，说明针刺起到了治疗作用。D组治疗后心率与治疗前基本相同，说明针刺没有明显作用。B组造模后心率比A组明显减慢，有显著差异（P0.05)（见表1）。

2．2．2心律变化经舌下静脉注射异搏定后大鼠即出现心动过缓和房室传导阻滞等心律失常波形。给予电针针刺双侧“内关”穴3min后窦性心律有所恢复。电针“足三里”穴3min后心律无明显变化（见表1）。以上心率（律）的变化证明了“内关”穴对心律失常有特异性治疗作用。

2．2．3Gi Gs含量的变化 B组（造模后）Gi含量与A组比，心肌组织内Gi含量升高（P0.05)（见表2）。

3讨论

G蛋白在生物学领域有广泛的运用，包括细胞增殖、信号转导、蛋白合成和蛋白的靶向作用[4]。许多激素，神经递质等化学信息是通过膜受体、G蛋白、效应子（如特殊离子通道K＋、Ca2+、腺苷酸环化酶、磷酯酶C）组成的跨膜信息系统而发挥作用[5]。G蛋白的种类很多，但是它们的分子结构相似，都是由α、β和γ3种亚基组成。其中α亚基差别最大，具有特异性，最能反映G蛋白的功能，所以根据G蛋白α亚基的不同G蛋白被分为Gs家族、Gi家族等。Gs家族能激活腺苷酸环化酶(AC)使细胞的cAMP含量增加，使细胞产生兴奋效应。Gi家族能抑制AC使细胞的cAMP含量降低，使细胞产生抑制效应[6]。在心脏中，G蛋白有多种表达，因此，可推断G蛋白与心脏功能关系密切，在心脏功能调节中也具有重要作用。G蛋白对窦房节起搏细胞(PC)离子通道的调节是其调节心率的主要机制[7]。实验发现Gsα可以直接活化PC的If（非选择性Na＋、K＋通道）通道，还可活化L型Ca2+通道，增加Ca2+内流，从而加速PC舒张期去极化，加快心率；另一方面，Giα则能够抑制If及Ca2+内流，并通过开放乙酰胆碱通K＋道从而导致PC diastolic超极化，从而减慢心率。基于Gsα、Giα对Ca2+内流的影响，G蛋白对房室传导的影响分为加速或减慢[8]。

“内关”穴是手厥阴心包经之络穴、八脉交会穴，又与阴维脉相通；心包经和手少阳三焦经相表里，故针刺内关可以通三焦,调诸脏,心居上焦，故受其调节，针刺“内关”穴对心律失常有调整作用。

从结果（表2）可以看出，在大鼠心率减慢时，心肌组织中Gi含量明显增加，Gs含量有所减少（B组）；而经过针刺“内关”穴后的大鼠，其心肌组织中Gi、Gs含量基本恢复到造模前水平（C组），其心率（律）也逐渐恢复正常；而针刺“足三里”穴的大鼠心肌组织中Gi、Gs含量与造模后（B组）的相比较无明显变化（D组）；证明了“内关”穴治疗心律失常的特异性。正常大鼠针刺“内关”穴后，其心肌组织中Gi、Gs含量与正常对照组无明显变化（E组）。本实验证明了针刺“内关”穴可使异搏定所致缓慢性心律失常大鼠心率（律）趋于正常，使心肌组织中激动性G蛋白（Gs）和抑制性G蛋白（Gi）的含量改变，提示针刺“内关”穴对缓慢性心律失常的调节作用可能是通过G蛋白的信号转导通路实现的，为临床针灸治疗心律失常治疗提供了理论依据。

参考文献

[1] 邓祖国，张勋，田培燕.信号转导［J］.黔南民族医专学报，2000，3：44.

[2]高天礼，包晓峰，马玉玲．针刺“内关”、“神门”治疗动物实验性心律失常及其作用途径的探讨[J]．北京大学学报（自然科学版），1980(4)：71－76.

[3]李忠仁.实验针灸学（新世纪全国高等中医药院校规划教材）［M］．北京：中国中医药出版社，2003：329.

[4] Kjeldgaard M,Nyborg J， Clark BF .The GTP binding motify:variations on a theme[J].FASEB Journal，1996，10：1347－1368.

[5]巴建明，鸟苷酸结合蛋白与内分泌疾病[J]．国外医学•内分泌学分册，1994，11（2）：59－62.

[6]王英伟.G蛋白的基本特性及其在临床麻醉中的意义[J]．国外医学•麻醉学与复苏学分册，1994，15（6）：336.

[7] Brown AM.A cellular logic for G protein coupled ion channel pathways［J］.FASEB J，1991，5：2175-2179.

[8]李晓辉.G蛋白在心脏功能调节中的作用［J］.四川生理科学杂志，1997，19（4）：11－13.