治疗白癜风外用中药对大鼠皮肤微环境的影响

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇治疗白癜风外用中药对大鼠皮肤微环境的影响范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要：目的：从调节局部免疫、影响黑素细胞黑素合成和迁移3个方面研究外用中药对大鼠皮肤的作用。方法：用中药乙醇提取液外涂大鼠背部皮肤，3周后活检取材，用半定量RT―PCR检测酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)、干细胞生长因子(stem cell factor，SCF)、干细胞生长因子受体(stem cell factor receptor，c-KIT)、白介素-2(intedeukine-2，IL-2)和肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor―a，TNF―a)tuRNA的含量。结果：中药3、5、6、7外用后，大鼠皮肤中scF mRNA表达显著增加，分别为对照组的2.59倍、5.82倍、2.60倍和3.74倍(P

关键词：白癜风；中药；皮肤；微环境；大鼠

中图分类号：B275.984.1；R-33　文献标识码：A　文章编号：1673―7717(2007)11-2362-03

白癜风的发病机理不清，尚无令人满意的治疗手段…。国内使用中药外搽在临床上取得较好的效果，然而对于中药引起白癜风复色的机制研究尚在摸索阶段，目前主要着眼于中药对黑素细胞的直接作用。在表皮中，角质形成细胞与黑素细胞密切联系构成“表皮黑素单位”并可通过分泌多种细胞因子影响黑素细胞的生物学性状；大量证据提示白癜风患者黑素细胞周围微环境存在异常，皮损区SCF、GM―CSF和bFGF等表皮促进因子表达显著降低，TNF―a和IL一6等表皮抑制因子表达则显著升高，而近年来用他克莫司进行局部免疫调节治疗白癜风取得了令人瞩目的效果；因此也不应忽视中药通过作用于皮肤中其他细胞从而间接干预黑素细胞的可能。在本文中，笔者研究了治疗白癜风有效的中药外用后对大鼠皮肤局部微环境尤其是角质形成细胞分泌的细胞因子的影响，现报道如下。

1 实验材料

1.1　实验动物

健康雄性SD大鼠3只(浙江中医药大学实验动物中心提供，普通级)，体重420～450g。每只大鼠背部取8个相离的区域，分别外涂药物，并以75％乙醇作对照，每天2次，连续3周。每日涂药前剃毛1次，3周后组织活检取材，进行总RNA提取。

1.2　中药

中药1：透骨草和浮萍各等份；中药2：白芷、蛇床子和补骨脂各等份；中药3：菟丝子；中药4：刺蒺藜；中药5：女贞子；中药6：维阿露(主要成份为驱虫斑鸠菊、补骨脂、何首乌、当归、防风等)；中药7：除白灵酊(主要成份为潼蒺藜、当归、红花等)。以上中药由杭州市第三人民医院中药房提供。用75％乙醇室温下密闭浸泡2周，并不时振荡。滤过除渣，收集提取液，制成每毫升相当于0.1g原生药的溶液。维阿露由新疆新时代制药有限责任公司生产，除白灵酊由本院制剂室生产。

1.3　试剂与仪器

Trizol(Invltrogen公司)，M-MLV逆转录酶、RNasin抑制剂、Taq DNA聚合酶、dNTPs(Fromega公司)。SmartSpec 3000紫外可见光分光光度计、PCR热循环仪、电泳图象分析仪(Bio―Rad公司)，低温离心机(Herae―us公司)，电泳仪(杭州博日科技有限公司)。

2　方法

2.1　引物

大鼠特异性引物由上海生工生物技术服务有限公司合成，β一肌动蛋白(β―actin)的一对引物序列为：5’-CATCTATGAGGGTrACGCG-3’和5’-CCAGGAT-AGAC.CCACCAAT-3’(产物长度548bp)；SCF的一对引物序列为：5’-GTCTACACCTGAGATCGC-3’和5’-AGACT-CACTACGCTrGAGAG-3’(产物长度374 bp)；干细胞生长因子受体(c-KIT)的一对引物序列为：5’-AGTGGAT-GACCTC GTGGC-3’和5’-GTATrACTGCTACTGCTGTC-3’(产物长度285bp)；酪氨酸酶(TYR)的一对引物序列为：5’-CCAATGCACCATCTGGACCT-3’和5’－CATGACATAGACTGAGCTGA-3’(产物长度272bp)；白介素-2(IL-2)的一对引物序列为：5’-CAGCTCGCATCCTGTGTIV,-CAC-3’和5’-GCTITGACAGATGGCTATCCA TC-3’(432bp)；TNF―a的一对引物序列为：5’-CGCATlTC・CAGTGTGTGGACTG-3’和5’-TGACAGGAGCTGAATC－CCTAC－3’(产物长度347bp)。

2.2　提取总RNA

按照Trizol说明书进行操作。用紫外分光光度计测定总RNA浓度，A260nm／A280nm为1.7～1.90置-70℃保存备用。

2.3　合成

eDNA取总RNA 2μg按照M-MLV逆转录酶说明书步骤进行操作获得eDNA。反应体系内含：5×RT缓冲液、M―MLV、RNasin、dNTPs、Oligo dT15，加无RNA酶水至总体积25μL。

2.4　PCR扩增

取eDNA 2μL进行PCR反应，反应体系内含：10×PCR缓冲液、Mgcl2、dNTPs、Taq酶、eDNA、引物，加双蒸水至总体积25μL。反应条件为：预变性94℃ 2min；变性94℃30s，退火：β-aetin、SCF和TYR为60℃ 45s，c-KIT为68℃45s，TNF-a为56℃45s，IL-2为55℃45s，延伸72℃60s，35个循环；最后72℃延伸10min。

2.5　电泳和图像分析

取PcR产物6μL经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶扫描仪上观察结果，拍照记录并用Quantity One-4.3.0软件测定扩增产物的光密度值，分别计算TYR、SCF、c-KIT、iL-2和TNF-a与β―actin光密度值的比值，以此代表上述指标mRNA的相对表达水平。

2.6　统计分析

所测数据采用成组t检验，使用SPSS1　3.0统计软件进行数据处理及分析。

3　结果

透骨草和浮萍的混合提取液及白芷、蛇床子和补骨脂的混合提取液均显著抑制大鼠皮肤IL-2和TNF-amR-

NA的表达，抑制率分别达57.0％49.5％和74.3％.77.2％(P

4　讨论

TYR是黑素合成中最为关键的一种限速酶，很多药物都是通过上调该酶的生物合成或对该酶的分子结构进行翻译后加工，增强其生物学活性来发挥作用的。一直以来，人们研究中药治疗白癜风的机制都以对酪氨酸酶的影响为标准。随着对白癜风研究的深入，新的治疗手段的出现及其机制的阐明，研究中药的思路得到了很大的启发。比如大量证据提示白癜风患者黑素细胞周围微环境存在异常，而近年来用他克莫司进行局部免疫调节成为白癜风治疗中的重要进展。Grimes等发现0.1％他克莫司软膏治疗后白斑处色素的恢复可能与该药抑制了TNF―a的表达有关；l_an等的研究证实外用他克莫司可能通过角质形成细胞为黑素细胞／成黑素细胞重新定居到白癜风皮损区创造了一个有利的环境。由此，笔者联想到对于成份复杂且作用呈现多靶点性的中药，是否也存在调节皮肤局部微环境从而促进白癜风皮损色素恢复的可能。

笔者的研究结果显示，众多中药中，女贞子外用后能明显上调TYR mRNA的表达，这与笔者先前的体外研究结果一致；菟丝子、女贞子等能不同程度上调大鼠皮肤中SCFmRNA的表达；透骨草和浮萍的混合提取液，白芷、蛇床子和补骨脂的混合提取液等则不同程度降低大鼠皮肤中IL-2和TNF―amRNA的表达水平。已知IL-2在免疫应答、免疫调节中起主要作用，而且白癜风患者皮损组织中IL-2水平升高；TNF―a能通过旁分泌方式抑制黑索细胞增殖和黑索合成；SCF与其配体c―KIT在维持黑素细胞的存活、诱导迁移、促进增殖与分化中起了极为关键的作用。因此局部皮肤中SCF的增加和TNF―aIL2的减少均可能有利于黑索细胞的生存。推测这些中药治疗白癜风有效的机制可能包括通过调节局部的细胞因子为黑素细胞的存活及迁移创造一个有利的环境。

本实验中观察到一个奇怪的现象，大多数中药在促进SCF mRNA表达的同时并没有相对平行地上调c-KITm-RNA的表达，反而抑制该基因的转录，其中的原因值得探讨，同时这似乎也说明了中药作用的复杂性。

中药治疗白癜风的机理可能涉及该病病因学的多个途径，笔者在本实验中只验证了其中若干指标，而且以正常动物为研究对象与白癜风的疾病状态也存在相当的差距。此外，本实验也未能说明皮肤中具体哪种细胞参与了相关因子mRNA表达水平的变化，这些都有待于进一步完善。