白木香肉桂酸―4―羟基化酶(C4H)基因的克隆及表达分析

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[收稿日期] 2013-10-28

[基金项目] 国家自然科学基金项目（31000136， 8117348

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2.4.2 C4H跨膜区及三维结构预测 采用TMHMM 2.0进行跨膜结构域预测； 采用SWISS-MODEL （） 对C4H蛋白的理化性质进行预测分析。推测其分子式为C2616H4140N722O725S16，相对分子质量 57.819 01 kDa，等电点pI 8.78。带正电残基（Arg+Lys） 65，负电残基（Asp+Glu） 60。该蛋白的不稳定系数为50.98，脂肪系数为99.78，亲水性系数为-0.184。

3.2.2 C4H跨膜区及三维结构预测 用TMHMM2.0预测C4H跨膜区域。蛋白含有2个跨膜螺旋结构，分别位于9～27位和445～463位氨基酸之间。由分析软件建立的C4H三维结构模型见图2。

图2 C4H蛋白的三级结构预测

Fig. 2 The 3 dimension structure of C4H

3.2.3 C4H氨基酸序列的分子系统进化分析 利用NCBI在线BLAST工具，将C4H与GenBank中18种植物的C4H蛋白进行比对，C4H蛋白与榄树、黄瓜等植物的C4H蛋白相似性达90%。通过MEGA 4软件采用相邻连接法构建C4H进化树，进行聚类关系分析，见图3。

3.3 白木香C4H基因在不同伤害处理时间的表达分析

健康的白木香只有受到外界伤害后才能产生沉香类物质。研究表明，机械伤害和化学刺激都能够诱导相关物质的产生[3-4]。为了研究C4H基因的表达是否受这些因素的调节，本实验采用荧光定量PCR的方法对C4H在不同处理下不同时间点的表达量进行了分析，见图4。本研究采用qRT-PCR分别检测未处理组对照组、机械伤害及100 μmol・L-1 MeJA分别处理（2，4，8，12，16，20，24 h）后C4H基因的表达情况，结果显示C4H基因在新鲜愈伤组织中表达量较低，在MeJA处理下，C4H基因的表达缓慢升高，20 h时达到最高表达水平，而后缓慢下降，但仍然高于健康中的表达水平；机械伤害对C4H基因的诱导强度明显强于MeJA处理，表达在8 h时到最大，然后急剧下降。

C4H序列来自GenBank数据库；图中数字为自举检验置信值（1 000个重复）。

图3 植物C4H氨基酸序列系统进化树

Fig.3 Phylogenetic analysis of C4H amino acid sequence

图4 机械伤害和MeJA处理后C4H的表达情况

Fig.4 Expression profile of C4H after mechanical and MeJA wounds

4 讨论

肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）是植物苯丙烷代谢通路中的第2个酶，该酶在植物细胞中的含量可以影响黄酮、木质素及芳香族类物质的合成等多条代谢支路[16]。逆境胁迫下，植物可通过调节一系列合成相关酶基因的转录水平从而影响其黄酮类和芳香族类的合成和积累[13]，其中就包括C4H。Ryan等[7]在矮牵牛花中的研究发现，UV-B胁迫处理下，C4H 等基因表达量的增加使得植物组织中总黄酮含量增加。Baek等[17]在黑莓中发现，黄酮积累量与C4H表达量在果实发育的不同时期表现了同步增加或减少的变化趋势。Liu等[18]发现K离子缺乏诱导的中C4H等基因的表达量减少，造成了该部位黄酮含量的降低。植物中有多个参与苯丙烷类代谢途径的P450酶类，其中C4H作为苯丙烷类代谢途径的第1个P450，其一级结构中与肉桂酸结合的特异氨基酸残基以及高级结构（二级结构和三级结构）所形成的活性中心口袋[19]，使其在结构和功能上与其他P450区别开来[13]。此外，植物黄酮的生物合成一般定位于内质网外膜上，由一系列特定的黄酮合成相关酶组成的多酶复合体连续合成并转运到特定的亚细胞结构中[20]。C4H的N-末端的膜锚定信号基（signal-anchor sequence），使其定位于内质网外膜上，参与苯丙烷类代谢途径中多酶复合体的亚细胞定位和内质网上电子链的化学传递[21]。

芳香族化合物是沉香药材的重要有效成分之一[22-23]，解析其生物合成途径是阐明结香机制和建立高效结香技术体系的分子基础。高通量测序技术是非模式药用植物基因挖掘的有效手段，课题组前期对白木香进行了转录组分析，从中得到大量关键合成酶基因片段[3，9]。本研究根据测序得到的C4H基因的转录本信息，成功从白木香中克隆了一个C4H基因的全长cDNA并对其进行生物信息学分析。结果表明，C4H和其他植物中已经鉴定的C4H具有较高的同源性及相类似的理化特性， 说明本研究克隆的C4H属于C4H基因家族。健康的白木香不能产生沉香， 只有受到伤害后才能被诱导产生，用典型的机械伤害及MeJA处理2种方法处理健康的愈伤组织，检测C4H基因的表达，发现C4H 基因显著受这2种伤害的诱导，该结果初步揭示了C4H基因在沉香形成中的可能作用。

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