高效液相色谱法同时测定异烟肼、利福平、吡嗪酰胺的实验研究

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摘要：目的 评价高效液相色谱法同时测定异烟肼、利福平和吡嗪酰胺药物浓度的可行性。方法 采用Water Spherisorb CN 5μm色谱柱；流动相为0.01mol/ml流动相为甲醇：乙腈=55：44，0.01mol/L庚烷磺酸钠（PH2.2），流速3.0ml/min；柱箱温度30℃；检测波长220～400nm；进样体积10μl；时间范围15min。结果 应用HPLC法同时测定三种药物浓度的相对回收率高于95%，绝对回收率均高于85%，且日内及日间的RSD均小于8%，符合生物样本的分析要求。结论 该方法精密度高，线性关系好，同时简单、准确、灵敏度高，为指导临床用药提供了依据。

关键词：高效液相色谱法（HPLC）；异烟肼；利福平；吡嗪酰胺

异烟肼（INH）、利福平（RFP）、吡嗪酰胺（PZA）是临床常用的一线抗痨药，因其作用机制不同，同时服用可杀灭处于各期的结核分枝杆菌，临床中监测血药浓度对结核病的治疗效果起着至关重要的作用[1，2]。分别测定异烟肼、利福平、吡嗪酰胺一种或两种的报道较多，但同时测定三种药物浓度的报道较少[3]，本研究应用高效液相色谱法同时测定异烟肼、利福平、吡嗪酰胺的药物浓度，以期为结核病的临床化疗提供理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料 日立D-2000高效液相色谱系统（HPLC），Waters CN（5μm），250mm*4.6mm色谱柱，LG10-2.4A高速离心机，电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），超声波清洗器，精密移液器。

1.2试剂 利福平、异烟肼和吡嗪酰胺标准品（北京中科三捷公司），纯度分别为99.5%，95.2%、99.5%，异烟肼（INH）、利福平（RFP）、吡嗪酰胺（PZA）原药（美国Sigma公司），庚烷磺酸钠（中国药品技术监督检验所），乙腈、甲醇（上海化学试剂有限公司），更烷基硫酸钠（上海化学试剂有限公司），蒸馏水。

1.3标准溶液配制 精密称取异烟肼（INH）30mg，利福平（RFP）30mg，吡嗪酰胺（PZA）120mg，置于100ml容量瓶中，加入适量甲醇溶解，用蒸馏水稀释至刻度，浓度分别为INH 300μg/ml，，RFP 300μg/ml，PZA 1200μg/ml，该药物配比是临床常用药物配比。将配置好的标准液避光保存于4℃的冰箱中待用。

1.4对比液配制 适量的甲醇用蒸馏水稀释，置于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，保存于4℃的冰箱中待用。

1.5色谱条件 Water Spherisorb CN 5μm色谱柱；流动相为0.01mol/ml流动相为甲醇：乙腈=55：44，0.01mol/L庚烷磺酸钠（PH2.2），流速3.0ml/min；柱箱温度30℃；检测波长220～400nm；进样体积10μl；时间范围15min。

1.6标准曲线和线性范围 精确吸取配制好的标准液置于10ml试管，配置成INH、RFP、PZA浓度为0.5μg/ml、0.5μg/ml、2μg/ml；1μg/ml、1μg/ml、4μg/ml；2μg/ml、2μg/ml、8μg/ml；4μg/ml、4μg/ml、16μg/ml；8μg/ml、8μg/ml、32μg/ml。将配置好的溶液用HPLC法测定，以待测液的浓度为横坐标，待测液的峰面积为纵坐标，分别求得INH的回归方程为Y=（X+475.9）/9469；RFP：Y=（X+1705）/6164；PZA：Y=（X+437.6）/17330，r=0.9994，线性关系良好。INH、RFP在0.5～10μg/ml范围内，PZA在2～40μg/ml范围内线性关系良好。

2结果

HPLC法同时测定三种药物浓度，三种药物在不同浓度下相对回收率高于95%，绝对回收率均高于85%，且日内及日间的RSD均小于8%，符合生物样本的分析要求。

3结论

异烟肼分子小，渗透力强，能渗入病变组织和细胞中，对细胞内外的结核杆菌均有很强的杀菌作用，主要的作用机制是抑制结核杆菌DNA合成；利福平对细胞内外代谢旺盛和偶尔繁殖的结核杆菌均有杀菌作用，常用异烟肼联合应用，单用极易产生耐药性；吡嗪酰胺对人型结核杆菌起抑制和杀灭作用，其抗结核作用的强弱与环境酸碱度有关，在pH5.0～5.5时作用最强[4，5]。细胞内环境为酸性有利于吡嗪酰胺发挥抗菌作用，因此对干酪样病灶的结核杆菌起杀菌作用，但单独应用极易产生耐药性[6，7]。由于作用机制不同，异烟肼、利福平和吡嗪酰胺同时服用可杀灭各期的结核分枝杆菌，同时能降低耐药性的产生，是各种治疗方案的常规用药[8，9]。

测定异烟肼、利福平、吡嗪酰胺中一种或两种药物浓度的方法国内、外文献均有报道[10，11]，但同时测定3种药物浓度国内、外文献相对很少。因异烟肼、利福平、吡嗪酰胺极性相差极大，其中以异烟肼极性最强，易受内源性杂质的干扰[12]。本研究采用0.01mol/ml庚烷磺酸钠溶液-乙腈（45：55，v/v）作为流动相，并选择最佳配比，其中乙腈对异烟肼与内源性物质的分离有重要作用[13]，调节pH可修饰峰拖尾，而且采用甲醇沉淀蛋白质后，药物损失少，测定方法简单方便，回收率高，精密度高，线性关系好，三种药物出峰干扰小[14]。

本文中同时测定异烟肼、利福平和吡嗪酰胺浓度的HPLC法，精密度高，线性关系好，同时方法简单、准确、灵敏度高，为指导临床用药提供了依据。

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