HPLC法测定线叶旋覆花中1,5-二咖啡酰奎宁酸含量
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[摘要] 目的：建立线叶旋覆花中1,5-二咖啡酰奎宁酸(IBE-5)的hplc测定方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱条件：Scienhome C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇－乙腈－5%醋酸(5∶20∶75，V/V/V)，流速：0.8 ml/min，柱温：25℃，检测波长：327 nm。结果：IBE-5在0.3～1.5 μg/ml之间与峰面积呈现良好的线性关系，其回归方程为Y=3 397.5X－46.92，r=0.999 9，平均加样回收率为103.5%，RSD为2.28%(n＝3)，旋覆花中IBE-5的平均含量为2.35%。结论：该测定方法简便、准确、分离效果好，可用于测定线叶旋覆花中IBE-5的含量。
[关键词] 旋覆花；1,5-二咖啡酰奎宁酸；HPLC
[中图分类号] R927.2[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）09（a）-032-02
Determination on the content of 1，5-dicaffeoyl quininc acid in the flowers of Inula lineariaefolia Turcz by HPLC method
WANG Cai-fang1,2, LI Hai-xia1, WANG Na1, ZHANG Qiu-rong1, MA Jing-jing1
(1.School of Pharmaceutical Sciences, Zhengzhou450051,China; 2.School of Pharmaceutical Sciences, Hangzhou310058, China）
[Abstract] Objective: To establish an HPLC method for the determination of 1,5-dicaffeoyl quinic acid(IBE-5) in the flowers of Inula lineariaefolia Turcz. Methods: HPLC method was developed. Scienhome C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column was used and mobile phase：methanol-acetonitrile-5% acetic acid(5∶20∶75，Ｖ/Ｖ/Ｖ)，flow rate：0.8 ml/min，column temperature：25℃，wavelength：327 nm. Results: The linearity relationship of IBE-5 was good in the range of 0.3-1.5 μg/ml. The equation of standard curve: Y=3 397.5X-46.92，r=0.999 9. The average recovery was 103.6%， RSD was 2.28%(n=3). The content of IBE-5 in Inula lineariaefolia Turcz was 2.35%. Conclusion: The method is reliable, simple and precise,which could be used as the determination of IBE-5 of the flowers of Inula lineariaefolia Turcz.
[Key words] Inula lineariaefolia Turcz; 1,5-Dicaffeoyl quinic aicd; HPLC
旋覆花为常用中药，始载于《神农本草经》，具有降气、消痰、行水、止呕等功效,中医用于风寒咳嗽、痰饮蓄结、胸膈痞满、喘咳痰多、呕吐噫气、心下痞硬等症[1]。1,5-二咖啡酰奎宁酸(简称IBE-5)为旋覆花的有效成分，具有多方面的生理活性，尤其在保护肝细胞、抗肝损伤、抗肝纤维化方面具有显著的作用[2,3]。有专利报道IBE-5具有治疗乙型肝炎和逆转录病毒感染有关的疾病的作用[4]。咖啡酰奎宁酸类普遍存在于菊科植物中，但未见到对IBE-5的高效液相色谱分析方法，作者采用反相高效液相色谱法首次对采自河南栾川县龙峪湾林场的线叶旋覆花(Inula lineariaefolia Turcz)中IBE-5进行含量测定，以期建立旋覆花中IBE-5的HPLC测定方法，为旋覆花的生产开发和质量控制提供科学依据，也为含有该成分的药材提供一定的参考。
1仪器与试药
Ailgent LC1200，VWD检测器，旋转薄膜蒸发仪（RE-52AA，上海亚荣），JHBE-50A闪式提取器（北京金鼐科技发展有限公司）；乙腈（色谱纯，天津四友），甲醇（色谱纯，天津四友），其余试剂为分析纯；IBE-5为作者自制，用HPLC面积归一化法测试其质量分数为99.50%；线叶旋覆花（Inula lineariaefolia Turcz）由作者自河南栾川县龙峪湾林场采集并鉴定。
2方法与结果
2.1色谱条件
Scienhome C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇－乙腈－5%醋酸水溶液（5∶20∶75，V/V/V）；流速：0.8 ml/min；柱温：25℃；检测波长：327 nm。色谱图见图1。
2.2对照品溶液的制备
取IBE-5对照品适量，精密称定，以甲醇制成0.15 mg/ml的对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备
精确称取线叶旋覆花样品8 g，利用闪式提取器进行破碎提取，甲醇溶液400 ml，提取时间2 min，提取2次，室温(20℃)，合并提取液浓缩至干，干浸膏用氯仿超声浸提一次，滤去氯仿液部分，将氯仿不溶物用甲醇溶解并转移至100 ml容量瓶，用流动相定容至刻度，作为储备液。精确吸取该储备液0.5 ml至10 ml容量瓶，流动相定容至刻度。此即为旋覆花样品液。进样量10 μl。
2.4标准曲线的制备
分别精密吸取0.15 mg/ml IBE-5对照品溶液，配制成一系列浓度0.3、0.6、0.9、1.2、1.6 μg/ml标准溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值。以峰面积积分值为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，IBE-5在0.3～1.5 μg/ml与峰面积积分值呈现良好的线性关系，其回归方程为Y=3 397.5X－46.92，r=0.999 9。
2.5精密度试验
取IBE-5对照品溶液，重复进样5次，测定其峰面积积分值，计算得其RSD为0.87%，各取供试品A液和B液，重复进样5次，测定IBE-5峰面积积分值，RSD分别计算得1.02%和2.16％。
2.6稳定性试验
取供试品溶液，分别在0、1、2、3、4、5 h进样测定，5 h内IBE-5峰面积积分值稳定，其RSD分别为1.01%（n=6）。
2.7重复性试验
取线叶旋覆花，按“2.3”项下制备方法制备5份，各进样10 μl测定，计算得IBE-5的峰面积积分值RSD为2.54%。
2.8加样回收试验
精密称取已知含量的线叶旋覆花3份，分别加入精密称定的IBE-5对照品，按“2.3”项下制备方法制备3份供试品溶液，进样测定，计算IBE-5的质量分数，结果见表1。
2.9样品测定
分别精密吸取样品液10 μl，注入高效液相色谱仪，依照上述色谱条件测定峰面积，按标准曲线法计算IBE-5，结果见表2。
3讨论
试验中考察了甲醇－水(10∶90，V/V)、甲醇－5%醋酸(40∶60，V/V)等多种色谱条件，最后确定在甲醇－乙腈－5%醋酸(5∶20∶75，V/V)、流速0.8 ml/min、柱温25℃下，对照品保留时间较短、峰形良好，供试品液中对照品峰与其它杂质峰能得到较好的基线分离。
供试品溶液制备时考虑到药材为花类，含有较多的色素等脂溶性杂质成分，该类成分可能会严重污染色谱柱，也将影响到样品的分析时间，故而曾试验了多种提取液进行除杂的方案，排除了用活性碳吸附色素的设计方案，方案中活性炭对IBE-5的吸附较多，最后作者确定采用提取液浓缩至干再用氯仿超声提取一次的方法，氯仿液进行薄层色谱分析，未见到IBE-5的斑点，且氯仿未溶物部分在薄层色谱中斑点纯度较高，高效液相色谱峰形良好，出峰时间约在10.26 min。
[参考文献]
[1]楼之岑,秦波.常用中药品种整理和质量研究(北方编)[M]．北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995．576.
[2]孙燕荣.二咖啡酰奎宁酸抗实验性肝损伤及肝纤维化的研究[D]．广州：第一军医大学硕士学位论文，2001．67.
[3]孙燕荣，董俊兴，吕秋军,等.二咖啡酰奎宁酸对大鼠肝原代细胞保护作用的研究[J].药学学报,2004,20(2):81-84.
[4]董俊兴，汤仲明，米志宝,等.二咖啡酰奎宁酸在治疗乙型肝炎及与逆转录病毒有关疾病中的用途及新咖啡酰奎宁酸衍生物[P]．中国：96111691．2002-07-17．
（收稿日期：2008-07-21）
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