过氧化氢通过激活氧化应激诱导成骨细胞凋亡

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【摘 要】目的：探讨氧化应激状态诱导成骨细胞系MC3T3-E1凋亡中线粒体途径的作用。方法：采用MTT法检测不同浓度过氧化氢处理后MC3T3-E1的增殖情况；Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测细胞凋亡；JC-1流式细胞学检测线粒体膜电位；DCFH-DA流式检测ROS活性。结果：MC3T3-E1过氧化氢处理后，细胞增殖明显抑制呈剂量效应关系，ROS活性和凋亡增加，线粒体膜电位降低。结论：过氧化氢可以增加细胞内ROS水平，通过激活线粒体途径诱导细胞凋亡。

【中图分类号】R751 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0030—01

随着社会人口的老龄化，骨质疏松已经成为一个世界性的公共卫生问题[1]。骨形成和骨吸收在其发病机制中起到了重要的作用，而在各种类型的骨质疏松的发病过程中都伴随着氧化应激水平的升高[2，3]，但是氧化应激在骨质疏松发病中的具体机制还上不明确，本实验通过对诱导成骨细胞氧化应激，探寻其在成骨细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠MC3T3-E1成骨细胞株购自美国培养物保存中心 （ATCC，CRL-2593，USA），α-MEM培养基购于GIBCO公司，胎牛血清购于Hyclone公司，H2O2购于碧云天公司， Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于北京赛宝克公司，DCFH-DA和JC-1荧光探针购于Molecular Probes公司。

1.2 细胞培养

小鼠MC3T3-E1细胞培养于含10% FBS、的α-MEM培养基当中。实验分为五组：正常组，0.4 mM组（过氧化氢终浓度为0.4 mM），0.6 mM组（过氧化氢终浓度为0.6 mM），0.8 mM组（过氧化氢终浓度为0.8 mM），NAC组（0.6 mM的过氧化氢+25 mM的NAC）。

1.3 细胞凋亡检测

采用Annexin V-FITC/PI法检测。10 μl的Annexin V， 5 μl的PI染液，避光孵育，流式细胞仪进行检测，CellQuest? 软件进行分析。

1.4 细胞内ROS水平检测

细胞内的ROS水平采用DCFH-DA荧光探针进行检测。30 μM 的DCFH-DA 于37℃孵育1 h。用无血清的α-MEM培养基洗细胞3次后，流式细胞仪进行检测。

1.5 线粒体膜电位检测

细胞线粒体膜电位采用JC-1荧光探针进行检测。JC-1工作液（300 nM JC-1），37℃孵育30 min后，倒置荧光显微镜进行检测，并分析荧光强度。此外，细胞加药处理后，常规消化，JC-1染色后，流式细胞仪进行检测，并分析JC-1阳性率。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.1统计学软件进行统计学分析。数据采用 ±s表示，多组间比较采用ANOVA分析，两两比较采用SNK检验，P

2 结果

2.1 H2O2诱导MC3T3-E1细胞凋亡

0.4，0.6，0.8 mM H2O2处理MC3T3-E1 24 h 后可以引起明显的凋亡（图1A）。早期相对凋亡率及细胞总相对死亡率明显增加（图1B）（*P

3 讨论

骨质疏松症是指单位体积估量减少伴有骨强度的降低，主要与骨吸收和骨形成的动态平衡破坏相关。成骨细胞的数量和活性决定了骨形成水平，从而影响骨量[4]。成骨细胞的凋亡在骨质疏松当中起到了重要的作用，成骨细胞的凋亡增加，导致了成骨细胞数量的减少，骨形成水平降低，骨量减少[5]。

氧化应激水平在机体的生理和病理过程中起到了重要的调节作用，高水平的氧化应激状态可以细胞和机体一系列的代谢紊乱，直接和间接的降低细胞和机体的正常生理活性，并引起相关的病理改变[6，7]。目前研究表明，几乎所有类型的骨质疏松，包括老年性骨质疏松、绝经期骨质疏松、糖尿病性骨质疏松等患者体内ROS水平都明显高于同龄健康人群[8，9]，表明氧化应激水平可能是一个独立的因素引起骨质疏松。我们通过使用过氧化氢增加成骨细胞MC3T3-E1内ROS水平造成成骨细胞内氧化应激水平的增高，来探究成骨细胞在氧化应激状态下的凋亡及其机制。实验表明随着过氧化氢量的增加，成骨细胞内ROS水平增殖升高，并随氧化水平的增高，细胞增殖活性明显下降，而凋亡明显增加，在使用抗氧化剂NAC后，细胞内的ROS水平降低，细胞凋亡明显减轻，表明氧化应激水平的升高可以诱导成骨细胞的凋亡。

总之，本研究表明，随着过氧化氢浓度的升高，细胞内ROS水平显著升高，使线粒体膜电位下降，线粒体通透性增加，从而激活线粒体凋亡途径，引起成骨细胞凋亡。这为骨质疏松的防治提供了理论依据。

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