蜂胶HPLC指纹图谱的2种分析方法

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摘要: 采用共有峰率和变异峰率双指标序列分析法和聚类分析法研究蜂胶提取物的hplc指纹图谱，比较两者的异同.结果表明：双指标序列分析法和聚类分析法都能反映蜂胶HPLC图谱的特征.前者利用共有峰率和变异峰率能指明任意2张样品图谱的差异，从而反映2个样品组分的差别，但样本量多时计算工作量大；后者能较快聚类大量的HPLC指纹图谱特征，并提供直观的分类图，但对图谱特征的鉴别能力不如前者.

关键词: 蜂胶；HPLC图谱；双指标序列分析法；聚类分析法

中图分类号:R 2841

文献标志码:A文章编号:1672-8513(2012)01-0013-05

Study on Two HPLC Analysis Methods for Propolis

LEI Yu, ZHUANG Honglin, BI Yufeng, DAI Yun

(Key Laboratory of Ethnic Medicine Resource Chemistry, State Ethnic Affairs Commission & Ministry of Education, Yunnan University of Nationalities, Kunming 650500, China)

Abstract: The common and variation peak rate dual-index sequence analysis and cluster analysis were compared for studying HPLC fingerprint of the extracts from propolis. The results showed that both methods can reflect the characteristics of propolis HPLC. The former indicates differences between two arbitrary sample HPlC, which reflects the difference of the two samples' components, but large samples may increase the amount of calculation. The latter can quickly cluster a lot of HPLC fingerprint, and provide intuitive classification figure, but the identification of the characteristics of HPLC is inferior to the former method.

Key words: propolis；HPLC；dual-index sequence analysis；cluster analysis

HPLC具有高效、快速、灵敏、重现性好、应用广泛等特点，现已成为中药质量控制的首选方法［1-3］.双指标序列分析法和聚类分析法是目前应用于化学图谱研究中常用的分析方法.双指标序列分析法以每个样品的HPLC指纹图谱为参考，指定一个图谱作为基准，计算其它图谱与该图谱的共有峰率和变异峰率，按共有峰率和变异峰率排成一个序列，从该序列可简单明了地知道任意2张图谱的差异.聚类分析法是研究分类问题的一种方法，在此，“类”指的是HPLC谱图相似特征的集合［4-6］.研究HPLC指纹图谱特征信息的提取分析方法，对于快速处理指纹图谱数据并实际应用于中草药及天然产物及其制品的质量控制具有积极的意义.

蜂胶是蜜蜂从植物新生枝腋芽处采集的粘性保护物，再经蜜蜂混入其上颚腺分泌物反复加工而成的一种具有芳香气味的胶状物质.蜂胶中含有多种化学成分，其中的黄酮类化合物是蜂胶发挥其生理功能的主要活性物质［7-10］.蜂胶具有药效作用是其中各种成分协同作用结果，在弄清蜂胶基础化学物质组成的基础上，我们也需要对蜂胶中的药效物质组进行整体的质量评价.目前关于蜂胶的HPLC方法研究主要集中于对其中化学物质的定性定量分析研究方面［11-13］，还未见利用双指标序列分析法和聚类分析法研究蜂胶HPLC指纹图谱的报道.本论文在课题组前期工作［14］基础上，采用上述2种方法对HPLC指纹图谱进行比较研究，旨在为蜂胶的质量控制研究提供新思路.

1 实验部分

1.1 实验仪器

Agilent 1200 色谱仪（美国安捷伦公司）；KQ-600DB型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；电子分析天平（奥豪斯国际贸易有限公司）.

1.2 实验材料与试剂

粗蜂胶样品：购自云南3个产地，分为不同质地9个批次，由昆明医学院提供；去离子水；磷酸（AR）；甲醇、乙腈均为色谱纯.

1.3 蜂胶乙醇提取物的制备

蜂胶乙醇提取物参照文献［14］制得.

1.4 HPLC样品制备及分析条件

准确称量0.1g蜂胶提取物，置于10mL容量瓶中，加入10mL甲醇定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤备用.采用AgilentXDB C18柱（4.6mm×150mm，5μm）为色谱柱；用乙腈、甲醇和pH=3的磷酸水溶液为流动相，流速0.8mL/min，流动相按一定比例进行梯度洗脱；柱温：30℃；扫描波长:320nm.

1.5 蜂胶提取物HPLC图谱的建立和数据处理

按选定色谱条件进行分析，相同条件下每个样品平行测定3次，相对标准偏差为0.3%.另取样品每天测定1次，连续测定7d，计算日间相对标准偏差为0.4%，说明方法日内精密度和日间精密度均满意.采用该方法对9批样品分析的结果见图1.

2 实验理论与数据处理

2.1 双指标序列分析法

双指标指共有峰率P指标和变异峰率Pv指标.其中，P可以反映2张图谱的相似情况，共有峰率越大，2张谱图越相近，说明2个样品所含的共有物质越多.Pv可以衡量指纹图谱的变异情况，变异峰率越大，2张谱图差异越大，说明2个样品所含物质差异性越大，变异峰率越小，说明2个样品或它们的某些性质类似.

共有峰率P=共有峰数（Ng）/2张色谱图中的独立峰数（Nd）•100%；

共有峰数Ng：指在比较的2张色谱图谱中都出现的色谱峰个数，即含有相同的主成分数；

独立峰：指单一成分的色谱峰；

独立峰数Nd：相互比较的2张色谱图中的独立峰总数；

变异峰率Pv：为该色谱图中相对于共有峰的变异峰数与其共有峰数的比值；

Pva=(na/Ng) •100%, Pva为指纹图谱a的变异率.na为指纹图谱a相对与其共有峰的非共有峰数，称为a的变异峰数；

Pvb=(nb/Ng) •100%，Pvb为指纹图谱b的变异率.nb为指纹图谱b中相对与其共有峰的非共有峰数，称为b的变异峰数；

Na= Ng+ na，Na为指纹图谱a的总峰数；

Nb= Ng+ nb，Nb为指纹图谱b的总峰数.

2.2 聚类分析法

聚类分析(Cluster Analysis, CA)是一种研究分类问题的多元统计分析方法［15］，它能够将一批变量或数据根据其诸多特征，按照性质上的亲疏程度在没有先验知识的情况下进行自动分类，产生多个分类结果,类内部的个体在特征上具有相似性，不同类间个体特征的差异性较大.本文在弄清蜂胶基础化学物质组成的基础上，根据其指纹图谱特征，使用SPSS 18.0软件进行自动分类，提供直观树状分类图，可以对蜂胶样品的整体质量进行评价.

2.3 HPLC指纹图谱数据提取

以保留时间标记每张原始色谱图的总峰数，数据如表1所示，其中，S1,S2,S3,S4分别代表产自草坝的1,2,3,4号的蜂胶样品；S5,S6,S7,S8分别代表产自罗平的1,2,3,4号的蜂胶样品；S9代表宣威的蜂胶样品.

3 实验结果与分析

3.1 云南蜂胶HPLC指纹图谱序列分析

原始图谱采用积分处理，分别按照公式计算2个样品的共有峰率和变异峰率.9批蜂胶样品的双指标序列分析结果如表2所示.

表2中S1∶S2(75.0;5.6,27.8)表示该序列片段表示以样品S1为参考，样品S2与样品S1之间的共有峰率为75.0%，S1的变异峰率是5.6%，S2的变异峰率是27.8%，其它数值同理.

通过以上数据可知，S1,S2,S4,S6,S9任意2张谱图之间的共有峰率都在63.3%以上； S3,S5,S7,S8任意2张谱图之间的共有峰率都在66.7%以上.我们可大致将蜂胶样品分为2类，｛S1,S2,S4,S6,S9｝分为一类，｛S3,S5,S7,S8｝分为一类.两类之间的任何2个谱图的共有峰率基本在50%以下，只有S2∶S8，S4∶S8，S8∶S9的共有峰率在50%左右，分别为51.6%，50.0%，53.8%.出现这种情况的原因是2种蜂胶样品的某些性质类似.继续细分，第1类中的｛S1,S4,S6｝为一类，共有峰率在85.0%以上，S1:S4的共有峰率可达94.7%.｛S2｝，｛S9｝各为一类，它们之间的共有峰率只有66.7%.同上分析第2类中的｛S3,S7,S8｝为一类，｛S5｝为一类.

3.2 基于SPSS 18.0的HPLC光谱聚类分析

9批蜂胶样品应用SPSS 18.0软件进行聚类分析.由图2可知，阈值为25时蜂胶样品被分割为2个类群，{S1,S4,S6,S9 ,S2}为一类，｛S3, S7,S8 ,S5｝为一类.阈值为6时蜂胶样品被分割为5个类群，｛S1,S4,S6｝为一类，｛S2｝为一类，｛S9｝为一类，｛S3,S7,S8｝为一类，｛S5｝为一类.

3.3 双指标序列分析法和聚类分析法的比较

由双指标序列分析法可知，在不同的序列中，样本之间的共有峰率差异很大.按共有峰率的高低，可大致将近似的样本归类，聚类分析法使用SPSS 18.0能快速的聚类，在树状图中依据阀值按需聚类.以上2种方法对蜂胶提取物的分类结果一样.双指标序列分析法需自己统计，能比较任意2个样品的差别，而聚类分析法使用软件能提供直观聚类图.

4 结语

蜂胶由于采集的树种和地域不同，所含化学成分及其含量差别较大.在利用HPLC方法对样品性质进行综合评价时，必须考虑色谱保留值及峰容量2个方面的因素，即需要考察保留时间及峰面积的情况.双指标序列分析法的优势是可以准确将不同样品保留时间数字化，以便从不同图谱的指纹特征中找到共性和差异，从相似度方面对样品进行归类，这是其他方法不易做到的，但其不足是当样本量大时统计麻烦，计算量很大；聚类分析法的优势是可对指纹图谱保留时间进行快速聚类，并用树状图直观地反映分类情况，其不足是当不同图谱的指纹特征差异小时鉴别能力有限，无法对2张指纹图谱进行准确比较.以上2种方法各有特点，都可以用于样品的质量评价.在样本量不大时，可用双指标序列分析法，当样本量大且特征差异大时，可以考虑聚类分析法，实验分析时可根据具体情况选择适合的方法.

以上2种分析方法不仅为蜂胶的质量评价提供科学依据，也对其它天然产物及其制品的质量控制研究提供思路.

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