无糖组织培养核桃生根技术

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核桃（J.regia L.）落叶乔木，是重要的干果树种，具有较高的营养、食用和药用价值[1]。其树干也具有很高经济价值的木材。核桃为异花授粉，因其实生苗繁殖易丧失优良种性，嫁接繁殖时伤口易发生褐变，因此成活率仅为30%左右。核桃试管繁殖研究起始于二十世纪八十年代，但其组培生根问题长期以来一直没有得到很好的解决[2-4]。随着组培技术的发展，核桃的快繁技术也取得了较大的进展，然而要实现工厂化生产，目前还存在一定的难度。传统的胚胎发育途径繁殖再生植株率极低，且易发生变异。核桃本身含有单宁物质，根在移栽过程中容易氧化，致使成活率低。这些都是困扰核桃组培苗工厂化生产的重要原因。据国内外的研究报道，核桃实生苗生根仅30%左右，本实验的目的就是利用无糖组织培养技术探讨提高核桃实生苗生根问题。

材料与方法

材料

实验于2009年在中国农业科学院环发所环境工程实验室，利用北京林科院提供的带有腋芽的核桃嫩枝为供试材料。

实验中诱导和分化使用同一培养基为DKW+6BA1mg/L+IBA0.05 mg/L；生根使用DKW+IBA5 mg/L培养基。两种培养基中蔗糖成分为30 g/L，琼脂为0.5 g/L。文中培养基所有单位为质量比。

方法

取带有腋芽的嫩枝，倒上洗涤液，自来水冲洗30min，75%的酒精消毒30 s，无菌水冲洗3～4 次，0.1%的升汞消毒10～15 min，用无菌水冲洗3～4 次，在超净台中将带有腋芽的茎段放入①组培养基中，培养20 天以后长出丛生芽，丛生芽长到3 cm后，分株移到新的①组培养基中。在培养室中进行培养做后续试验（核桃试管苗的诱导和分化，核桃的无糖生根培养）

培养室的温度在28±1 ℃左右。湿度为80%±2%，光照时间为12 h/天，光照度为2000 Lx。

数据使用SAS统计分析。

结果分析与讨论

核桃试管苗的诱导和分化

在超净台中将消毒后的带有腋芽的茎段放入分化培养基中，培养20 天以后长出丛生芽，丛生芽长到3 cm后，再一次转移到分化培养基中进行分化（如图1）。

分化和继代培养基：DKW+6BA1 mg/L+IBA0.05 mg/L。其中上述培养基蔗糖浓度为3%，琼脂浓度为0.50%。

核桃的无糖生根培养

生根诱导培养基：DKW+IBA5 mg/L。蔗糖为3%，琼脂为0.50%。上述培养基的pH值为6～6.5。生根DKW培养基不加任何激素。实验容器选可耐高温高压的塑料方盒或玻璃罐头瓶。

一组：DKW培养基，琼脂为0.50%，蔗糖为3%，放在组培室常规培养。二组：DKW培养基，琼脂为0，蔗糖为0，液体培养基倒入蛭石基质中。放入无糖培养箱中，由植物无糖培养环境控制系统自动控制。

在无糖培养箱进行培养时，温度要比培养室的温度高2～3 ℃，这样更有利于核桃生根。温度为28±1 ℃ ，湿度为80%±2%，CO2浓度为1500±50 μL/L，光照时间12 h/天，光照度为2000 Lx。培养30 天左右，即长成3 cm左右的根，生根率为98%（如图2～4）。

通过30 天核桃生根后的图片对比可以看出，无糖蛭石的生根数明显优于有糖蛭石的常规培。在培养30 天后，分别调查了两种处理核桃植株的株高、叶片数、根数、鲜重等性状，结果如表1。

通过调查数据的方差分析（表1），从表1中可以看出，无糖蛭培养基的株高、叶片数、根数和鲜重都显著高于有糖蛭石常规培养，特别是根数两种处理呈现出极显著差异。

讨论

核桃是较难发生不定根的树种之一（郗荣庭等，1996），从本质上讲生根过程是改变组织活细胞现有的基因表达模式，使之向有利于根源基发生的模式转变的过程。

本实验将根已经长到3 cm左右的试管苗移栽的营养钵中，基质为蛭石+草炭土，蛭石：草炭土为2：1，放在盒子中，基质的水分为手攥为团即可，每天喷雾浇水，用塑料膜覆盖保湿，3天后将覆膜掀起一角通风。5 天后出新叶。20 天后稳定成活。核桃无糖培养生根苗移栽后，在实验室的驯化阶段，核桃苗生长良好，成活率为95%以上。通过无糖组织培养，提高核桃生根率，实现了核桃的组培苗的工厂化生产。由于核桃本身在移栽过程中，组培苗移栽后存在休眠，在今后的实验中，希望打破休眠或缩短休眠期，提高核桃的移栽成活率。

无糖培养在核桃生根过程中可能提供了CO 2气体，进行强制自主呼吸，加强了呼吸强度，加大了气孔的开闭程度，增加了植物本身的光合强度。使植株生长旺盛，得到了茁壮的组培生根苗（图5）。

从实验看出，无糖蛭石培养的核桃苗株高、叶片数、根数、鲜重显著高于有糖蛭石常规培养的生根状况。通过实验核桃生根率从30%提高到98%左右，使核桃生根技术有了重大突破。为今后的核桃移栽奠定了基础。

【参考文献】

[1] 郗荣庭，张毅萍. 中国果树志（核桃卷）[M]. 北京：中国林业出版社，1996，20-27.

[2] 陈正华. 木本植物组织培养及其应用[M]. 北京：高等教育出版社，1986，456-465.

[3] 张建成，张晓伟. 核桃试管苗生根培养的研究[J].《河北林果研究》，2005，20（4）：361-365.

[4] 裴东，袁丽钗，奚声珂.核桃品种试管嫩茎生根的研究[J]. 林业科学，2002，38（2）：32-38.