黑布药膏对兔耳增生性瘢痕Bax和Bcl-2 mRAN表达的影响

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[摘要]目的：研究黑布药膏对兔耳增生性瘢痕bax和bcl-2mran表达的影响。方法：成年大耳白兔24只，建立兔耳增生性瘢痕动物模型，21天后,将瘢痕动物模型随机分为黑布药膏治疗组和瘢痕模型组，在黑布药膏治疗组瘢痕局部涂抹黑布药膏，每3天1次，连续用药56天。在用药后第2，4，6，8周分别切取两组瘢痕组织，通过实时定量PCR（RT-PCR）法检测 Bax和Bcl-2mRAN的表达。结果：黑布药膏治疗组和模型对照组比较，Bcl-2 mRAN表达显著减弱（P

[关键词]黑布药膏；兔耳增生性瘢痕；成纤维细胞；细胞凋亡

[中图分类号]R619+.6[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）05-0764-03

Effect of Heibu Ointment on the expression of Bax and Bcl-2 mRANin the hypertrophic scarring models in rabbit ears

ZHAO Li1,WANG Ying2，GUAN Hong-quan2

(1.Liaoning College of Health Vocational Technology,Shenyang 110101,Liaoning,China;2.Liaoning College of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,Liaoning,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of Heibu Ointment on the expression of Bax and Bcl-2 mRAN in the hypetrrophic scarring models in rabbit ears.MethodsTwenty-four white rabbits were used to establish the modles of hypertrophic scar in ears．After twenty-one days,the modles were randomly divided into Heibu Ointment treatment group and modle group,Heibu Ointment was plastered on the hypetrrophic scarring ofHeibu Ointment treatmentgroup once every three days, it was continued fifty-six days. The material was respectively taken on the second,the fourth,the sixth and the eighth week,To detect the expression of Bax and Bcl-2 mRAN by Real Time PCR(RT-PCR) technique.ResultsThe expression of Bcl-2 mRAN was viously weaker than the controls(P

Key words：Heibu Ointment;hypertrophic scarring of rabbit ear;hypetrrophicscar;fibroblast；apoptosis

增生性瘢痕(Hypertrophicscar，HS)是病理性瘢痕的一种，是机体创伤后过度修复的表现，其发生机制目前尚不完全明了，有研究证实其产生与细胞凋亡有密切的关系[1]；细胞凋亡是由凋亡相关基因编码的蛋白调节控制。Bax能够促进细胞凋亡，而Bcl-2则能抑制凋亡的发生，二者间的动态平衡对细胞凋亡的发生起着重要的影响作用[2]。为此，我们采用实时定量PCR技术检测Bax和Bcl-2mRNA的表达，研究黑布药膏对其表达的影响，以探讨黑布药膏治疗增生性瘢痕的作用机制。

1材料

1.1动物：选大耳白兔24只，雌雄不拘，体重1.5～2.0kg，动物等级为清洁级，购于沈阳药科大学实验动物中心，许可证号SCXK（辽）2009-6602。自由进食，实验前正常预养1周，实验期间为同一饲养条件及环境。

1.2药物：黑布药膏（老黑醋250g，五倍子100g，蜈蚣1.2g，蜂蜜100g）购于辽宁中医药大学第一附属医院，按文献记载煎煮。将药物放入砂锅内，置于炭火上煎，熬成黑色稠膏，并在熬膏时，用玻璃棒搅匀，储存在玻璃罐中备用，并存放于4℃冰箱备用，1g膏含生药0.84g。

1.3 试剂与器材：Triozol Reagent（美国Invitrogen Life technologies公司）、引物合成（北京华大基因公司）、荧光定量PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；小型台式离心机（美国SIGMA, 1-13）、高速冷冻离心机（美国sigma 31k5C型）、PCR扩增仪（德国Biometra）、紫外分光光度计(英国UV-visible Spectrometer, UV300)

2方法

2.1分组与造模：大耳白兔24只，分笼饲养7天后，将24只兔子随机分3组，即正常对照组（A组）、瘢痕模型组（B组）、黑布药膏治疗组（C组），每组8只。A组不施加任何处理因素，B，C组进行HS造模，造模方法参照文献[3]，3%戊巴比妥（30mg/kg）麻醉下，用圆形钻刀在每只兔耳腹侧面沿长轴避开血管，各做4个直径6mm的圆形全层皮肤缺损创面，深达软骨表面，每个创面间隔2cm以上。术后常规抗感染，自由进食。术后21天，创面愈合，突出于皮肤表面，形成HS。术后第21天开始，B组不治疗，C组在瘢痕处涂抹黑布药膏1g，直径约8mm，厚约2mm，A组在与C组瘢痕对应处皮肤上涂抹相同重量、面积和厚度的黑布药膏，A、C组每3天换药1次，连续用药56天。在上皮化后2，4，6，8周分别切除B、C组HS各16处及A组对应部位正常皮肤16处，共计取材192处。各组组织置于1ml Trizol中，-70℃冻存。

2.2实时定量PCR检测Bax、Bcl-2mRNA表达：①抽提总RNA参照Trizol说明书采取一步法提取总RNA, 紫外分析及电泳测总RNA的纯度、浓度及完整性；②逆转录合成cDNA按照反转录反应试剂盒操作方法操作，反应条件：37℃，15min，85℃，5s；③PCR扩增应用ABI 7500 扩增仪。反应条件： 95℃，30s（1个循环）。95℃，5s；60℃，34s（40个循环）；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s（1个循环）；④PCR反应设置检测文件，反应结束后，使用Sequence Detection software version 1.2.3软件(Applied Bisystems公司)分析PCR过程每个检测样本的cT(Threshold cycle)值，得出Ct值，按公式2-Ct求出基因表达的相对变化量[4]，然后进行各组间比较。

2.3 统计学处理：采用SPSS13.0进行数据处理，数据以x±s表示，组间比较用t检验，P

3结果

3.1大体观察：在兔耳腹侧面形成创面后，伤口约13～15天后愈合，愈合过程中上皮化时即能触到硬块，此硬块不断高于皮面，淡红色，增生范围不超过原创沿，19～22天时增生到最高峰，厚度约为兔耳腹面皮肤厚度的3倍左右。而且随时间推移，模型组变化不大，一直处于增生状态（见图1～4）。黑布药膏治疗组随着给药时间的延长，瘢痕开始逐渐软化，体积逐渐缩小，趋于平复，色变淡（见图5～8）。

3.2 BaxmRNA检测结果：与正常组比较，模型组BaxmRNA表达降低（P

3.3 Bcl-2mRNA检测结果：与正常组比较，模型组Bcl-2 mRNA表达增加（P

4讨论

4.1 增生性瘢痕是组织创伤后过度修复的一种反应，表现为成纤维细胞的大量增殖和胶原等间质蛋白的沉积。中医理论认为，瘢痕多为风火气郁，痰湿凝聚，气滞血瘀，余毒搏于肌肤所致。黑布药膏是赵炳南的经验方，其组成为：老黑醋250g，五倍子100g，蜈蚣1.2g，蜂蜜100g。方中老黑醋软坚解毒，五倍子收敛解毒，蜈蚣破瘀解毒，蜂蜜调和诸药，共奏破瘀软坚之功效。

4.2 在增生性瘢痕发生过程中，瘢痕组成细胞能分泌多种生长因子，这些生长因子一方面通过自分泌或旁分泌方式，直接促进表皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞增殖，在引起肉芽组织过度增生的同时，刺激胶原、纤维粘连蛋白和聚葡萄糖胺等细胞外基质的大量合成和分泌；另一方面，这些细胞因子还能抑制修复细胞趋向凋亡[5]。说明增生性瘢痕的发生可能与修复细胞的凋亡减少相关。细胞凋亡（apoptosis）是机体在生长发育过程中和受到外来刺激时清除富余、衰老或受伤的细胞，以保持机体内环境平衡的一种自我调节机制[6]。细胞凋亡可能由凋亡相关基因编码的蛋白调节所控制，是多种促进因素和抑制因素共同作用的结果。Bcl-2家族成员是细胞凋亡过程中的一类调节因子，该基因家族包括两类功能相反的基因，一类是抑制细胞凋亡的基因如Bcl-2基因，另一类是促进细胞凋亡的基因如Bax等基因。Bax基因与Bcl-2基因在组织中广泛表达，当外界信号引起细胞凋亡时，bax与线粒体膜相结合，两个bax蛋白相互聚合形成同二聚体，促进细胞凋亡。当Bcl-2基因转录增强，蛋白含量升高时，Bcl-2与Bax形成比Bax-bax更稳定的异二聚体，从而抑制bax促细胞凋亡的作用[7]。

4.3 本研究结果显示，在增生性瘢痕中，bax基因表达明显低于正常皮肤，而bcl-2基因表达显著增强，这说明增生性瘢痕与bax和bcl-2基因表达变化密切相关，凋亡受阻可能是增生性瘢痕形成的原因之一。经黑布药膏治疗后，bax基因表达明显高于模型组，bcl-2基因表达明显低于模型组，说明黑布药膏通过降低 Bcl-2mRNA的表达，增加Bax mRNA表达，从而促进成纤维细胞凋亡，抑制成纤维细胞增殖，使瘢痕消退，这可能是黑布药膏治疗增生性瘢痕的机制之一，为临床应用黑布药膏治疗增生性瘢痕提供了实验依据。

[参考文献]

[1]Desmouliere A,Redard M,Darby I,et a1．Apoptosis mediate the decrease in cellularity during the transition between granulation tissue and scar[J]．Am J Pathol,1995,146(1):56-57．

[2]Park JP,Hockenbery DM．Bcl-2，a novel regulator of apoptosis[J]．J Cell Biochem,1996,60(1)：12-15．

[3]李荟元,刘建波,兰海.建立增生性瘢痕动物实验模型[J].第四军医大学学报,1998,19(6）：655-657.

[4]Livak KJ,Schmittgen TD．Analysis of relative gene expression data using rael-time quantitative PCR and the2(-Delta Delta C(T))Method[J]．Methods,2001,25(2):402-404．

[5]付小兵,王德文.创伤修复基础[M].北京:人民军医出版社,1997:127-166．

[6]Majno G,Jotis I．Apoptosis,oncosis and necrosis：an overview of cell death[J].Am J Pathol,1995,146(2):3-15．

[7]陈伟,付小兵．增生性瘢痕中凋亡相关基因转录的变化[J]．中华实验外科杂志，2005，22(2)：235-237．

[收稿日期]2011-03-11 [修回日期]2011-04-22

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