蛋白质组学技术及其在植物逆境生物学中的应用
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摘要：逆境胁迫是制约植物生长发育、影响作物产量和质量的关键因子，揭示植物应答胁迫的分子机理一直是人们长期探索的重大课题。植物的蛋白质组学研究可以系统揭示不同胁迫条件下植物蛋白质的表达状况，从而深入了解环境胁迫下植物的基因表达调控机制、植物响应胁迫机理。简要介绍了蛋白质组学的研究技术，概述了其在植物逆境胁迫适应机制研究中的应用，并对蛋白质组学在该领域的发展前景进行了展望。
关键词：蛋白质组学；非生物胁迫；生物胁迫；双向电泳；质谱
中图分类号：Q946.1；Q945.78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5403-06
随着生命科学的日益发展，对基因功能的研究已不仅仅局限在核酸水平。蛋白质是基因功能的执行者，是生命现象的直接体现者。要深入了解生命的复杂活动，就需要从蛋白质的整体水平上进行研究。蛋白质组学是指研究蛋白质组的科学，本质上是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于组织变化、细胞代谢等过程的整体而全面的认识[1]。近些年来，蛋白质组学发展迅速，并得到了广泛的应用，成为生命科学研究的核心内容之一。
植物在生长发育过程中会遭遇高（低）温、干旱、水涝和高盐等非生物胁迫以及病原菌侵染和虫害等生物胁迫。植物感受逆境信号后，可以通过信号转导调节细胞内抗逆相关蛋白的表达，从而调整自身的生理状态或形态来提高对逆境的耐受能力。在蛋白水平，对发生变化的蛋白质进行定性和定量测定，探讨植物在逆境胁迫条件下的调控机制，是研究植物抗逆性的重要手段之一，并已在多种植物的研究中取得了一定的成果。
1 蛋白质组学研究技术
过去，许多科学家都致力于蛋白质组的大规模定性分析，而现在，如何系统地识别和定量一个蛋白质组则是蛋白质组学研究的主要目的之一[2]。由于蛋白质的浓度在很大程度上影响了其功能的实现，因此，对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量也就变得至关重要。目前，比较成熟的蛋白质定量方法主要分为两类，一类基于传统双向凝胶电泳及染色，另一类基于质谱检测技术。
1.1 基于凝胶的定量蛋白质组学技术
双向电泳（Two dimensional electrophoresis，2DE）技术是由O’Farrell于20世纪70年代建立的[3]，具有高分辨率的特点，通常能分辨出1 000～3 000个蛋白点[4]。该技术自诞生以来，一直在不断改进和优化。目前，应用比较广泛的双向电泳技术主要是双向荧光差异凝胶电泳（Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）。但双向电泳本身也存在着一些弊端：试验重复性差；对蛋白质的分离受到蛋白丰度、等电点、相对分子质量和疏水性等的限制；自动化程度低；操作起来费时费力等，这些都在一定程度上限制了该技术的应用。
1.2 基于质谱的定量蛋白质组学技术
基于质谱的蛋白质组学定量技术可以分为两大类：标记定量技术（Labeling quantitation）和非标记定量技术（Label-free quantitation）[2]。此外，标记或非标记的鸟枪蛋白质组学策略也是基于质谱技术的常用方法。
1.2.1 标记定量技术
1.2.1.1 同位素代谢标记法
同位素代谢标记以同位素元素或同位素标记氨基酸形式掺入到细胞培养基中，在细胞生长代谢过程中完成蛋白质同位素标记。此方法的显著优点是蛋白质在样品制备的初期被标记，由此减少了试验操作造成的误差，从而提高了准确度。目前比较常用的方法包括15N体内代谢标记和细胞培养中稳定同位素标记氨基酸（Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）方法。
1）15N体内代谢标记法。采用含有15N（或14N）作为惟一氮源的培养基来培养植物组织（植株），依靠掺入合成蛋白质的15N实现定量[5]。这项技术适用于多种蛋白提取物的蛋白质定量，包括那些需要进行大量纯化步骤、蛋白产量易发生改变的[6]。其优势还在于可应用于水培植物，使得植物对养分的吸收得到更好的控制。
2）SILAC方法。依靠在培养介质中加入稳定同位素标记的必需氨基酸（如赖氨酸或精氨酸等）实现对蛋白质的定量，已经广泛用于高等动物细胞蛋白质的鉴定及定量[5]。SILAC法标记效率高、损失小；标记误差低，可靠性高。然而，由于植物细胞本身可以合成这些必需氨基酸，导致只有部分蛋白质被标记。并且，此方法成本较高，导致其在植物蛋白质组学研究中的应用受到了一定的限制。
1.2.1.2 同位素化学标记法
1）同位素亲和标记法。比较典型且已商业化的一项技术是同位素亲和标记技术（Isotope coded affinity tages，ICAT）。ICAT 无需繁冗的双向凝胶电泳技术，标记策略灵活多变，可对低丰度、难溶性蛋白进行分析。近些年来，该技术与不同的质谱技术联合应用得到了广泛的研究。但ICAT适用于含半胱氨酸或半胱氨酸存在修饰的蛋白质。
2）酶催化18O-同位素标记法。酶催化18O-同位素标记法是通过加入H218O，在蛋白酶催化作用下将羧基上的2个16O替换成18O，从而对肽段进行标记。该技术有以下优点：操作简单；标记效率高，准确率高；应用范围广，可用于多种不同类型的蛋白质；可标记所有酶解的肽段，使相对定量所有的蛋白质成为可能；反应条件温和、副产物少；便于与磷酸化肽段富集方法联用，适于低丰度磷酸化肽段的定量标记肽段；在蛋白质水解分裂的同时被标记上，避免了人为因素的干扰。但由于标记后的蛋白质样品过于复杂，该技术还有待进一步的完善。
3）相对和绝对定量同位素标记法。相对和绝对定量同位素标记（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技术是美国应用生物系统公司在 2004 年推出的一项新的体外同位素标记技术[7]。该技术使用8种（或4种）不同的同位素试剂来同时标记和比较8种（或4种）不同的蛋白质样品。如今该技术的应用越来越广泛，其优越性也逐步在许多生物体和组织研究中得到了证明，已成为目前蛋白质组学定量方法中一个十分重要的技术。
iTRAQ技术有如下特点：①样本量大。可对多达4个样本同时相对量化，大大降低了试验过程中所引入的技术误差；②定性分析结果可靠。可以同时给出每一个组分的相对分子质量和丰富的结构信息；③灵敏度、准确度高。将离子抑制效应、背景噪音和仪器条件等系统误差的影响降到最小，获得的变异系数在9%的范围；④分离能力强，分析范围广。作为标记的反应不在活细胞，适合任何类型的蛋白质样品，包括高相对分子质量蛋白质、酸性蛋白质、碱性蛋白质、不溶性蛋白质（eg.膜蛋白）等；⑤分析时间快，自动化程度高。
当然，iTRAQ标记技术也有自己的局限性。对全组蛋白质而言，它只能对相对丰度进行比较，因此只能提供相对的定量；数据的复杂度更高，因此需要开发更多的信息学工具；高丰度蛋白质干涉了低丰度蛋白质的检测和鉴定；每次试验，研究人员都必须鉴别全部的蛋白质组[8]。
1.2.2 非标记定量技术 非标记定量法（Label-free）是一种新兴的蛋白质定量方法，包括基于色谱峰面积定量法及利用二级离子信号的强度进行MRM（多反应监测）检测等。与标记定量法相比，非标记定量法不需要花费大量时间准备同位素化合物，也不需要使用非常昂贵的试剂，但该技术比较依赖于仪器的状态、样品的复杂性以及一些未知因素，其灵敏度和精确度都不及标记定量法。要得到广泛的应用，非标记定量技术还需要进一步的优化和改进。
1.2.3 鸟枪蛋白质组学策略 鸟枪法首先采用标记或非标记的方法将蛋白质混合物降解成肽段的混合物，利用质谱进行分析测序，然后利用计算机技术描绘出肽段在蛋白质上的位置图谱，从而确定该混合物中的蛋白质成分。其代表方法是MudPIT。
自然界中有多种非生物和生物因子都会对植物的生长发育造成不利影响，严重时甚至会导致植物的死亡。植物对这些逆境胁迫都有很强的响应机制，可通过一系列从细胞到生理水平的应答反应来适应这些不利的环境条件。应用蛋白质组学技术研究在逆境胁迫下植物蛋白质种类及表达量的变化，将有助于人们从整体和动态的蛋白质水平了解胁迫因子的伤害机制以及植物的适应机制。
2.1 非生物胁迫的植物蛋白质组学研究
2.1.1 温度胁迫 温度是影响植物生长发育和农作物产量的重要环境因子。目前的研究较多集中于温度胁迫下差异表达蛋白质的鉴定和植物响应高温、低温分子机制的解析。
Ganmulla等[9]将24日龄水稻秧苗的叶片分别在5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）的低温和28 ℃（36 d）、36 ℃（44 d）的高温环境下处理3 d，并检测其蛋白质组变化。采用无标记的鸟枪法，对每个处理组的3个生物学重复进行了蛋白质定量分析。结果表明，在一个或多个处理组中被鉴定出来的蛋白，有超过400个都对温度胁迫进行了响应。其中，分别有43、126和47个蛋白专一地出现在了5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）和36 ℃（44 d）处理组中。并且，与其他温度处理相比， 12 ℃（20 d）处理后的水稻叶片蛋白质组发生的变化更显著。另外，该试验还鉴定出了20个新的胁迫响应蛋白。
为了检测在成熟的硬质小麦子粒中热胁迫对非醇溶谷蛋白积累所产生的影响，Laino等[10]将意大利栽培种Svevo进行了2个不同的温度处理（热胁迫和对照）。通过检测非醇溶谷蛋白的2-D模型，鉴定出了在灌浆期受热胁迫影响的多肽。这项研究共发现了132个表达发生变化的多肽，其中有47个（包括HSPs和胁迫相关蛋白）是通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）和基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOF-MS）鉴定出来的。很多热诱导的多肽被认为会引起敏感植株的反应。
2.1.2 水分胁迫 近年来，研究人员利用蛋白质组学，已鉴定出一些水分胁迫响应关键因子，并揭示出植物应答水分胁迫所涉及到的多个代谢通路。
Ford等[11]在2011年首次采用鸟枪蛋白质组策略研究了小麦（Triticum aestivum L.）栽培种在干旱胁迫下的蛋白丰度变化。对不耐旱种Kukri、耐旱种Excalibur和耐旱种RAC875在温室中进行周期性干旱处理，处理结束后从叶片中提取蛋白，共鉴定出5 125个肽段，并分析出1 299个蛋白。从中选择了159个在所有时间点都有表达的蛋白用iTRAQ技术进行相对定量。在不同时间点，3个栽培种的蛋白组变化反映了它们对干旱胁迫的不同生理响应。结果显示，在胁迫处理前期，Excalibur没有明显的蛋白组变化，而RAC875的蛋白组发生了显著变化。这3个栽培种的蛋白组变化都与它们的氧化胁迫代谢和活性氧清除能力相一致，表现为超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的增多以及参与光合作用和卡尔文循环的蛋白的减少。
祁建民等[12]以鉴定出的耐旱性红麻品种GA42为材料，在5叶期设置正常供水与控水比较试验，运用双向电泳分析红麻在干旱胁迫和正常供水条件下叶片蛋白质组的动态变化。在干旱胁迫下出现65个差异表达蛋白质点，选择表达量明显上调的9 个蛋白质点，通过MALDI-TOF-TOF MS分析和数据库检索，鉴定出6个差异表达蛋白，分别是2个核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶或其大亚基、1个Rubisco活化酶、1个二甲基萘醌甲基转移酶、1个推测的胞质型谷氨酰胺合成酶以及1个ATP合酶β亚基。试验证明，红麻GA42表现出较强的耐旱性与上述6个差异表达蛋白质点明显上调有关。
Komatsu等[13]将发芽2 d的大豆在水涝胁迫下处理2 d，从大豆的根系和下胚轴中提取蛋白质。经SD-PAGE和CBB染色后，在每张凝胶上得到具有可重复性的蛋白点约803个。水涝胁迫引起了21个蛋白点的表达量升高，其中有定位/贮存相关蛋白（11个）、能量相关蛋白（3个）、信号转导相关蛋白（2个）、初生代谢相关蛋白（2个）、细胞结构相关蛋白（1个）、病害/防御相关蛋白（1个）以及转运蛋白（1个）。同时，7个蛋白点的表达量在水涝胁迫处理后降低，包括4个定位/贮存相关蛋白和3个病害/防御相关蛋白。
2.1.3 盐胁迫及渗透胁迫 土壤盐分过多是影响植物生长发育、导致农业减产的主要因素之一。盐胁迫对植物的危害主要体现在渗透胁迫和离子胁迫等方面。
Barkla等[14]对植物质膜在盐胁迫下的作用进行了研究，鉴定出了参与调控液泡中Na+隔离的蛋白质。对盐胁迫处理的冰叶日中花和对照进行的双向差异凝胶电泳分析表明，质膜包括质膜H+-ATPase 和V-ATPase的亚基，都与醛缩酶和烯醇酶这两个糖降解酶相关。利用免疫共沉淀证实糖降解酶与V-ATPase的B亚基VHA-B存在相互作用。体外试验证明，醛缩酶可以通过吸引ATP来激活V-ATPase的活性。采用拟南芥烯醇酶突变体进行生物学功能验证，发现这些突变体对盐胁迫敏感，并且在其质膜中，醛缩酶激活V-ATPase水解活性的能力减弱。糖降解蛋白与质膜的这些联系直接上调了质子泵的活性。
Bandehagh等[15]对油菜盐胁迫响应机制进行了研究，分析了耐盐的油菜栽培种Hyola 308和不耐盐的栽培种Sarigol的第二片新叶和第三片新叶中蛋白的表达。对处于营养生长期的植株分别进行0、175和350 mmol/L的NaCl处理。与第二片新叶相比，第三片新叶中的Na含量较高且生长势较弱。不耐盐植株中Na的积累比耐盐的植株中更加显著。2-DE凝胶检测出了900多个蛋白点，其中有44个和31个蛋白的表达量分别在耐盐和不耐盐的基因型中发生了变化。聚类分析发现，根据第二片新叶的盐含量可明显区分出这两种不同的基因型。MS分析鉴定出了46个蛋白，包括参与氧胁迫响应、能量供应、电子转运、翻译和光合作用的蛋白。
Skirycz等[16]研究了拟南芥叶片在缓和而持久的渗透胁迫下的适应能力。通过15N代谢标记法分析了蛋白变化。结果表明，质体的ATPase、卡尔文循环和光呼吸都被下调了，但线粒体的ATP系统被上调了。这说明线粒体在植物遭受水分胁迫时对保护质体起到很重要的作用。此外，胁迫下的转录组和蛋白组数据非常一致，但很多蛋白与蛋白合成和降解相关，推测其受到了转录后水平的调控。
张恒[17]用不同浓度的Na2CO3对星星草（Puccinellia tenuiflora）进行处理，研究了其在盐胁迫下的应答机制。应用iTRAQ标记法对蛋白质组进行定量分析，发现叶绿体中68种Na2CO3应答蛋白质，它们主要参与捕光复合体、光系统Ⅱ、光合电子传递链和光系统Ⅰ的形成、能量代谢、卡尔文循环、光合色素代谢、基础代谢、胁迫防御、转录、蛋白质合成与命运，以及信号转导等过程。
2.1.4 营养胁迫 为了解水稻对磷缺乏的适应性，Torabi等[18]分析了亲本株系Nipponbare与其近等基因系NIL6-4（在第12条染色体上携带一个主要磷吸收的QTL）的根系在1和100 mmol/L磷浓度下生长的蛋白质组。2-DE检测到669个蛋白点，两种基因型中有32个蛋白有明显差异。其中，两种基因型在胁迫条件下有17个蛋白表现不同。质谱鉴定出参与适应磷缺乏途径的26个蛋白，包括活性氧清除剂、柠檬酸循环、信号转导和植物防御反应蛋白，还有一些未知功能蛋白。这说明不仅有一条控制适应磷缺乏能力的信号途径，可能还存在着不同途径间的相互作用。
Visioli等[19]对黑杨的一个高度抗钙胁迫的未定种进行了蛋白组变化分析。运用2-D液相色谱技术分离出126个蛋白。其中，有20个蛋白被鉴定为受到了钙胁迫的影响，并通过MALDI-TOF进行了指纹图谱分析。在胁迫处理的样品中，丰度较高的蛋白集中在叶绿体和线粒体中，说明这两个细胞器在植物对钙胁迫的响应中扮演了重要角色。
李坤朋[20]对两种不同基因型的玉米在富磷或缺磷条件下的蛋白质组变化进行了双向凝胶电泳分析，分别鉴定出79个和108个差异表达蛋白，功能解析表明，这些蛋白可能在调控玉米根系形态发育、细胞周期以及感知环境磷浓度变化等方面发挥了重要作用。
2.1.5 其他非生物胁迫 其他非生物胁迫如臭氧、重金属、机械损伤等对植物的影响，也在蛋白质组水平上取得了一定的进展。
肖清铁等[21]以抗镉水稻品种PI312777和镉敏感水稻品种IR24为材料，在不同镉离子浓度的条件下水培处理7 d。与对照相比，不同浓度镉胁迫下，PI312777中热激蛋白、谷胱甘肽还原酶、蛋白酶体α亚基6型、果糖-1，6-二磷酸醛缩酶、硫氧还蛋白和DNA重组修复蛋白均上调表达；而IR24中热激蛋白、谷胱甘肽还原酶、蛋白酶体α亚基6型的表达无显著差异，但果糖-1，6-二磷酸醛缩酶和硫氧还蛋白表达下调。此外，DNA重组修复蛋白仅在镉胁迫的PI312777叶片中表达。这些差异表达的蛋白质很可能是水稻PI312777比IR24具有更强镉抗性的生物学基础。
Fuhrs等[22]研究了豇豆蛋白质组对锰胁迫的响应，发现锰胁迫后豇豆叶绿体中与CO2固定和光合作用相关的蛋白丰度下降，说明锰胁迫对豇豆的能量代谢产生抑制作用。
乐寅婷等[23]对比了油菜（Brassica napus cv. Westar）在机械损伤前后可溶性总蛋白的含量变化，发现损伤后蛋白表达量增高。双向凝胶电泳分析表明有8个蛋白质点发生了明显的上调或下调，质谱鉴定出Rubisco小亚基前体、果糖-1，6-二磷酸醛缩酶和粪卟啉-3-氧化酶，这些蛋白质可能在油菜叶片应答机械损伤过程中起关键作用。
Ahsan等[24]用双向凝胶电泳法检测了在O3胁迫下大豆中蛋白质的变化，分别在叶片和叶绿体中鉴定出20个和32个差异表达蛋白。其中，参与光合作用（包括光系统Ⅰ/Ⅱ和碳素同化）的蛋白都在胁迫后表达量降低，而与抗氧化剂系统和碳代谢相关的蛋白表达量增高。参与糖代谢的酶活性在胁迫后增强，淀粉减少而蔗糖增加。试验表明在光合系统经受O3胁迫时，可能通过淀粉降解为三羧酸的循环功能，使碳分配受到了影响。
2.2 生物胁迫的植物蛋白质组学研究
2.2.1 病原菌侵染 病原菌侵染时植物局部会发生坏死并诱导产生一些抗病蛋白质。
Maserti等[25]以柑橘属（Citrus L.）的果树为材料，对二斑叶螨（Tetranychus urticae）侵染后和茉莉酸甲酯处理后的叶片进行了蛋白表达差异分析，分别检测出了110个和67个蛋白质点。应用液相色谱—串联质谱技术鉴定出50个蛋白，大部分都属于光合和代谢相关蛋白。其中有5个与氧胁迫相关的酶，包括磷脂谷胱甘肽过氧化物酶、1个盐胁迫相关蛋白、抗坏血酸过氧化物酶和锰超氧化物歧化酶。有7个防御相关蛋白，包括与发病相关的酸性几丁质酶、蛋白酶抑制剂类奇蛋白和低密度脂蛋白等。
采用双向电泳联用 MOLDI-TOF-TOF 质谱技术，张晓婷等[26]对水稻感病品种武育粳3号和抗病品种KT95-418感染水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）前后的叶片进行蛋白质组学分析。结果显示，RSV基因组编码的病害特异蛋白（Disease specific protein， DSP）在武育粳3号中的积累量明显高于KT95-418中。另外还鉴定出其他25个蛋白，包括RSV NS2蛋白，寄主中与光合作用、细胞氧化还原状态和离子平衡状态及蛋白的合成、转运与翻译后修饰等相关的蛋白。
钟云[27]选用广东主栽砧木资源——江西红橘的根系为材料，运用iTRAQ技术，分析了其接种黄龙病病原后第50天的根系蛋白。鉴定得到差异显著蛋白78个。差异蛋白主要参与生物代谢、防御反应、抗氧化、转运和几丁质代谢等。与转录组关联性强的差异蛋白有36个，其中半数与抗病（逆）相关。植株感病后韧皮部筛管闭塞有关的筛管阻塞蛋白上调了1.67倍，这与防御黄龙病病原有关。另外，枯草杆菌样蛋白酶表达是对照的282.09倍，说明该酶参与了黄龙病病原菌的抵御及根尖分生区的保护。
2.2.2 虫害 魏哲[28]利用iTRAQ技术筛选了水稻抗褐飞虱相关蛋白质。在褐飞虱取食96 h后的水稻叶鞘中，发现多种蛋白质表达量发生了显著变化。这些蛋白包括3个JA合成蛋白质（alpah-DOX、AOS和AOC），7个氧胁迫应答蛋白（CATA、APX2和5个POXs），3个β-葡聚糖酶（Gnsl、Gns4和Gns5），3个蛋白激酶（CRKS、CRK6和atypicalRLK），1个蛋白网格蛋白，1个甘氨酸分解系统H蛋白，5个光合作用相关蛋白和4个水通道蛋白。其中AOC、CATA、3个POXs、Gnsl、Gns5、3个蛋白激酶和网格蛋白更多地在易感性水稻株系中被诱导。
由于自然环境下植物时常遭遇多重逆境，因此，目前有不少针对植物逆境蛋白质组学的工作已不仅仅局限于单一胁迫，而是将相关性较高的几种胁迫进行整合研究。Zhang等[29]对云南假虎刺（Carissa spinarum）同时进行了42 ℃高温和干旱处理。在处理期和恢复期设置4个不同的时间点取叶片进行蛋白质组学分析，发现49个蛋白质点的表达量发生了变化。用MS和2-D凝胶法鉴定出30个蛋白，这些蛋白包括HSP、光合成相关蛋白、RNA加工蛋白以及参与代谢机制和能量生产的蛋白。Evers等[30]对马铃薯分别进行了冷胁迫和盐胁迫处理，并在转录水平和蛋白质组水平都进行了分析和研究。发现响应盐胁迫和冷胁迫的基因和蛋白有一致也有不同。在蛋白质组水平，大部分鉴定出的蛋白都在胁迫下表达增强了。大多数光合成相关蛋白的丰度在两种胁迫下都降低了。
3 展望
综上所述，作为后基因时代的一个重要研究手段，蛋白质组学已经在植物抗逆研究中广泛开展，获得了丰硕的成果，对传统的植物生理学及功能基因组学研究进行了补充。然而，植物对环境胁迫的响应是一个非常复杂的过程，人们对植物在逆境下产生的复杂的生物学反应都还知之甚少，在这方面的研究还处于初步阶段。随着越来越多植物全基因组测序的完成、EST数据库的日益丰富，以及研究手段的不断改进，相信将会有更多的与抗性相关的基因和蛋白被挖掘，更全面地揭示植物抗逆性的本质，为植物抗胁迫品种的选择和培育奠定基础。
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