过氧化氢和氨基酸混合液对谷胱甘肽发酵影响的研究

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摘要：目的 考察过氧化氢和氨基酸混合液前体对突变株YF（ZnCl2r，Ethr）生产谷胱甘肽（GSH）的影响。方法摇瓶培养，在不同添加时间分别添加不同浓度的过氧化氢和氨基酸混合液前体，测得GSH浓度，细胞干重。结果发酵9 h时添加12 mmol/L氨基酸混合液，GSH浓度提高了99.6 %。而过氧化氢对GSH发酵的影响不大。发酵12 h添加0.3 mmol/LH2O2和18 mmol/L氨基酸混合液，GSH浓度提高了114 %。结论氨基酸混合液能显著促进胞内谷胱甘肽的累积，氨基酸混合液和过氧化氢协同作用可有效的促进胞内谷胱甘肽的累积。

关键词：过氧化氢；混合氨基酸；谷胱甘肽；发酵

中图分类号：TQ920.1文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)07-0019-04

Study on Effects of Mixed Amino Acids and Hydrogen Peroxide on Production of Glutathione by Saccharomyces cerevisiae

CHEN Shan, HE Xiao-xian, PAN Ya-lei

(College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an, 710021, China)

Abstract：Objective To investigate the effects of mixed amino acids and hydrogen peroxide on the production of glutathione（GSH）by mutant strain YF（ZnCl2r, Ethr）. Methods At the shake flask level, the concentration of GSH and the weight of dry cell were measured with different adding amount of mixed amino acids and hydrogen peroxide at different time points. Results After fermentation for 9 hrs, mixed amino acids of 12mmol/L was added into the medium with the concentration of GSH to be increased by 99.6%. However, hydrogen peroxide could not obviously enhance the intracellular GSH level. After fermentation for 12 hrs, hydrogen peroxide of 0.3mmol/L and mixed amino acids of 18mmol/L were both added into the medium with the concentration of GSH to be increased by 114%. Conclusion Mixed amino acids can enhance the intracellular GSH accumulation in shaking flask culture and the synergy of mixed amino acids and hydrogen peroxide can also increase the intracellular GSH accumulation.

Key words：hydrogen peroxide; mixed amino acids; glutathione; fermentation

谷胱甘肽（glutathione，GSH），即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，具有γ-谷氨酰基和巯基生物活性的一种三肽化合物。本课题用H2O2刺激突变株YF（ZnCl2r，Ethr），研究它对GSH合成的影响。

微生物细胞是一个经济的体系，不会在胞内过量积累某一代谢产物。细胞只有处于不正常的生理状态下，出于保护自身的本能和抵御外界伤害时，才会对其代谢产物做出调整。人为提供适当的环境刺激，极有可能促进细胞合成目标代谢产物的能力。Riccillo[1]指出在极端环境下GSH对Rhizobium tropici的生存起着至关重要的作用。Duwat[2]也说明在L.lactis中外界胁迫作用下GSH对保护细胞生存具有重要意义。表明GSH在微生物细胞面临外界环境条件刺激和胁迫时，存在至关重要的抵御作用和响应机制，是细胞抗损伤及代谢调节的关键物质之一。基于此原理利用过氧化氢刺激细胞可提高目标产物产率。

此外，H2O2作为携氧剂可以分解成水和氧气，给细胞提供生长和代谢所需的氧。突变株YF（ZnCl2r，Ethr）发酵是好氧发酵，添加H2O2的同时也起到提高溶氧的作用，有助于细胞的生长和代谢[3]。加入H2O2还有细胞毒性低、成本低、操作简单及不会为产物分离带来困难等优点。

培养基中添加谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸可能会促进酵母胞内积累GSH。通常条件下的GSH发酵生产所需的这3种氨基酸是通过微生物细胞在糖类代谢基础上，经过一系列生化反应后自身合成的，其合成途径很容易受到细胞自身性能、状况以及外界营养、环境条件的影响。添加氨基酸前体物质可有效的解除限制GSH高产的因素。谭天伟等[4]在S.cerevisiae T65发酵生产GSH过程中，采取先加入半胱氨酸再加入谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸混合物的策略，GSH含量达到1 875 mg/ L，比不加提高了55.2 %。在摇瓶条件下，我们考察了不同浓度和不同添加时间的氨基酸混合液对诱变得到的突变株YF（ZnCl2r，Ethr）细胞生长和GSH合成的影响。这对利用酵母生产谷胱甘肽的研究有着重要意义。

1材料

1.1菌种

突变株YF（ZnCl2r，Ethr），由本院生物工程实验室保藏。

1.2试剂和培养基

保藏培养基（g／L）：葡萄糖20；蛋白胨20；酵母膏10；琼脂1.5%~2%；pH自然，0.1 Mpa，灭菌15 min。

种子培养基（g／L ）：葡萄糖20；蛋白胨20；酵母膏10；pH自然，0.1 MPa，灭菌15 min。

发酵培养基（g／L）：（NH4）2SO46；葡萄糖35；K2HPO4・3H2O3；KH2PO40.5；酵母粉11；MnSO40.1；KCl0.1；FeSO40.1；MgSO4・7H2O0.1。

其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.3仪器及设备

GT10-1高速台式离心机（北京时代北利离心机公司）；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台（苏州净化设备公司）；FA 2104S电子天平（上海电子天平仪器公司）；752紫外光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂）；HZQ-F160振荡培养箱（哈尔滨东联电子技术开发公司）

2方法

2.1种子培养

用接种环划线接种突变株YF（ZnCl2r，Ethr）菌种于保藏培养基的固体平板上，30℃培养24 h，即得所需种子。

2.2扩大培养

250 mL三角瓶内装10 mL液体培养基，挑取一环生长良好的种子接种，150 r/min，30℃培养18 h，即得所需种子液。

2.3摇瓶发酵培养

250 mL三角瓶内装30 mL液体培养基，10％的接种量，150 r/min，30℃培养30 h，培养基初始pH 7.0。

2.4测定

生物量测定：取发酵液5mL，5 000r/min离心5 min，水洗2次，将湿菌体和离心管一起经105 ℃烘干至恒重后称量W1，离心管经105 ℃烘干至恒重后称量为WO，细胞量W(g)= W1-WO。谷胱甘肽测定用四氧嘧啶法[5]。

3结果

3.1添加氨基酸混合液对谷胱甘肽发酵的影响

根据摇瓶发酵合成谷胱甘肽的曲线，在发酵0，6，9，12，18 h时在发酵液中分别加入总浓度为6，12，18，24，30 mmol/L的3种氨基酸混合液（L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸，摩尔比为1∶1∶1），发酵30 h后测得细胞干重（图1）和GSH浓度（图2），根据单位质量酵母产谷胱甘肽浓度求得GSH的含量（图3）。

由图可见氨基酸混合液对GSH的影响较大。图1、图2显示，在发酵9 h时添加12 mmol/L的氨基酸混合液可有效的提高GSH浓度，并且细胞干重也有所提高，GSH浓度125.53 mg/L时，相比于对照（不添加氨基酸混合液，30 h测得GSH浓度为62.88 mg/L）提高了一倍多。由图1可见，发酵不同时间段添加高浓度氨基酸混合液，会抑制细胞生长，表现为细胞干重降低。在发酵6，18 h时添加氨基酸混合液前体对GSH合成的影响不大。

3.2过氧化氢对谷胱甘肽发酵的影响

由于细胞在生长不同时期对H2O2的敏感度不同，因此，在GSH摇瓶发酵过程的不同阶段，即发酵6，9，12，18 h，分别添加0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 mmol/L浓度的H2O2，发酵30 h后测得细胞干重（图4）和GSH浓度(图5)，根据单位质量酵母产谷胱甘肽的浓度求得GSH含量（图6）。

由图4、图5可见，发酵6 h时添加不同浓度的H2O2，细胞干重和GSH浓度随着H2O2浓度增加而降低。发酵12 h时添加0.3mmol/LH2O2，GSH胞内含量和GSH产量较高，并且添加H2O2时的细胞干重和GSH浓度高于不添加H2O2（细胞干重8.36 g/L，GSH浓度62.88 mg/L），表明此时H2O2起了一定的作用。由图6可见，在发酵18 h时添加H2O2对GSH胞内含量和GSH浓度的影响不大， 对GSH发酵的影响明显小于氨基酸混合液，但是添加H2O2可以提高GSH产率。为了获得更高浓度的GSH，进一步考察添加H2O2和氨基酸混合液共同作用对GSH发酵的影响。

3.3H2O2和氨基酸混合液的协同作用对谷胱甘肽发酵的影响

上述表明，添加H2O2和氨基酸混合液均可增加GSH浓度和含量，为了考察H2O2和氨基酸混合液是否通过协同作用，取得增加GSH浓度和含量的效果，我们在细胞生长的不同阶段，添加一定浓度的H2O2和氨基酸混合液发酵30 h后，测得的数据见表1。

由表1可见，H2O2和氨基酸混合液前体的协同作用可有效的提高GSH的浓度和细胞干重。

并且当发酵12 h时，添加0.3 mmol/LH2O2和18mmol/L氨基酸混合液对GSH发酵有一定的作用，比未添加提高了114%。表明H2O2和氨基酸混合液前体共同作用可有效的促进GSH合成。

4结论

氨基酸混合液前体可有效的促进GSH合成，在发酵9 h时添加12 mmol/L的氨基酸混合液，比不添加的GSH浓度提高了99.6 %。添加H2O2对促进GSH合成没有很大的作用，但是，发酵12 h时添加0.3 mmol/L H2O2和18mmol/L氨基酸混合液时，其协同作用有效的促进了GSH的合成，比不添加两者的GSH浓度提高114%。

参考文献

[1]Riccillo P, Muglia C, de Bruijn FJ, et al. Glutathione is involoved in envirnonmental stress responses in Rhizobium tropici, including acid，tolerance[J]. J Bacteriol, 2000,182(6):1748-1753.

[2]Duwat P, Cesselin B, Sourice S, et al. Lactococcus lactis, a bacterial model for stress responses and survival[J]. Int J Food Microbiol, 2000, 55:83-86.

[3]欧杰，李柏林. 携氧剂(H2O2)对野油菜黄单胞菌合成黄原胶的影响[J]. 食品科学，2004，25（11）：215-217.

[4]Wen S H , Zhang T , Tan T W. Utilization of amino acids to enhance glutathione production in Saccharomyces cerevisiae[J]. Enzyme Microb Technol, 2004, 35:501-507.

[5]赵少欣，贺小贤. 还原型谷胱甘肽简便测定法[J]. 食品科技，2007，191（9）：219-220.