银耳多糖的分子修饰及抗氧化作用的研究
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摘要：用POCl3修饰酸水解银耳多糖所产生的单糖或低聚糖，并通过红外光谱分析，发现修饰后的产物含有磷酸基团；此外，通过邻苯三酚自氧化法，结合紫外光谱分析，对修饰前后产物的抗氧化性进行了比较研究，结果表明：在常温中性条件下，POCl3用量4%～5%，反应时间20～35min，旋转蒸发溶液只剩20～30mL时，可以使银耳多糖酸解出的产物充分磷酸化，且磷酸化修饰后产物的抗氧化作用有较明显的提高。
中图分类号 TQ464.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）17-17-03
分子修饰是通过化学、物理学及生物学等手段对化合物分子进行改造，以获得性能更加优良的结构类似衍生物的方法[1]。分子修饰可改变多糖的空间结构、分子量及取代基种类、数目和位置和生物活性，是多糖构效关系及其药物研究的有效手段；而构效关系研究结果又指导着多糖分子修饰的方向，可分析多糖结构和活性的关系，为其药物设计、研究和开发提供理论支持[2-3]。选择合适的方法对多糖进行分子修饰，可提高其生物活性或降低其毒副作用。为提高多糖活性，多糖分子修饰研究已有很大进展。将多糖或寡糖进行衍生化，如降解、硫酸化、磺酰化、乙酰化、烷基化等，对提高银耳多糖的水溶性、抗病毒活性或提高免疫力等功能具有良好的作用[4]。
银耳（Tremella fuciformis Berk），属菌类植物，素有“菌中之冠”美称，又名白木耳，是一种高等真菌，具有滋阴润肺、益气和血、补肾益精、强心健脑的功能。
银耳营养成分齐全，赖氨酸含量丰富，碳水化合物含量为65%～78.3%，其中银耳多糖就占了干重的60%以上，银耳多糖可提高机体的非特异性和特异性免疫功能，抑制肿瘤发生；银耳富含疏、磷、铁、镁、钾、钠及多种元素，对平衡人体代谢十分有益；银耳含脂类较少，且多为磷脂，因而对高血脂、高血压及动脉硬化患者有益；银耳中的粗纤维含量为2.4%～2.75%，对老年便秘患者相当有利；银耳还含有多种B族维生素，如硫胺素、核黄素等。
近年来，对银耳的化学成分及药理活性进行的许多研究和大量的现代药理证明，多数药理活性都与银耳多糖有关。从银耳子实体中分离到的多糖，相对分子质量1.15×105，由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸组成，总糖含量为75.7%，含葡萄糖醛酸14.7%。
通常把较高分子量的多糖，降解成较低的分子量，能显著提高其活性。选择适当的降解方法，将多糖降解到适宜的分子量，至关重要。目前降解多糖的方法主要有酸降解、酶降解和超声波降解等[5]。
本实验对酸水解后的银耳单糖或低聚糖用POCl3[6]进行分子修饰，以期改变其分子结构，增加磷酸基功能团，达到提高生物活性的目的。
1 原理和方法
银耳多糖是活性多糖中的杂多糖，是大分子，可以先将银耳多糖降解成小分子物质，再进行分子改造。
1.1 银耳多糖的酸解 酸降解的依据是，酸性溶液能引起多糖中糖苷键的断裂，使多糖降解为低分子片段，控制酸浓度、温度及时间可获得不同分子量大小的降解产物。
1.2 银耳多糖酸解产品磷酸化反应机理 将银耳多糖降解，得到以甘露糖为主的单糖或者低聚糖，然后用POCl3在适当的pH、用量和反应时间下，充分和银耳多糖的降解产物发生反应，生成具有磷酸基团的新产物，从而提高降解物质的抗氧化活性，增加其用途。
1.3 银耳多糖酸解产品的制备 先粉碎银耳，称量50g银耳粉置于900mL的烧杯里；再称量800mL蒸馏水加入900mL烧杯中，搅拌溶解烧杯内的银耳粉；接着移取占蒸馏水量20%的浓HCl，混匀搅拌，盖上保鲜纸；然后立即水浴，设定80℃，2h水浴；取出后，立即用氢氧化纳固体中和溶液中的盐酸至pH为7；然后，将溶液过滤，弃渣取液，放入冰箱保存。
1.4 银耳多糖酸解产品改性实验方法 先在溶液中加入适量的活性炭，将液体煮沸，自然冷却，接着抽滤，使之脱色；取无色透明液体300mL，均分为3个250mL烧杯装，其中2个加入不同量的POCl3，按液体4%～5%取量，然后加入每个250mL烧杯中，让其反应20～35min；反应完后，用旋转蒸发器将每个小烧杯的水分蒸出，将每间隔一段时间蒸出的氯化钠结晶取出收集起来，另外烘干，取烧杯内的液体继续蒸，直至得到修饰后较纯产品，设定旋转蒸发的温度为70℃；将产物制成丸粒完全烘干或半烘干。
1.5 银耳多糖酸解产品改性前后分子结构的测定方法 采用红外光谱法，称取经过充分干燥的三氯氧磷化后的银耳多糖酸解产物10mg，KBr压片测定其红外光谱。从中分析修饰之后和修饰之前产物的基团差异，寻找磷酸基团的存在。
1.6 银耳多糖酸解产品改性前后活性的测定方法 采用邻苯三酚自氧化法[7]。取4.5mL 0.1mol/L的Tris―HCl缓冲液，依次加入1.0mL乙二胺四乙酸钠溶液，1.0mL样品溶液，2.4mL水，混匀，于25℃水浴反应10min，再加入100μL 9mmol/L邻苯二酚，加入时计时，混匀，准确反应60min后，加入50μL 12mol/L HCl溶液，终止反应，立即在325nm处测定吸光度值AS。空白管以1.0mL蒸馏水代替1mL样品，操作方法同样品管，可测得空白管的吸光度AC。
清除率（%）=（AC―AS）/AC×100
式中：AS――含有待测物的反应液于325nm处的吸光度值；AC――不含有待测物的反应液于325nm处的吸光度值。
2 结果与分析
2.1 银耳多糖酸解方法的研究 本实验通过在80℃水温，2h、3h、4h的水浴时间下，将银耳粉和盐酸充分反应得到较纯的银耳多糖的分解产物，通过得率的比较，发现在80℃，2h的情况下，银耳多糖分解产物的得率最高。
2.2 改性方法的研究与反应工艺的确定 通过田龙、刘亚伟[8]对三氯氧磷交联木薯淀粉研究的启示，探索实验方法，对三氯氧磷安全用量进行了分析，最后发现在常温中性条件下，POCl3添加量占溶液体积的4%～5%，POCl3和银耳多糖酸降解产物的反应时间20～35min时，产物的三氯氧磷磷酸化的效果较好，得到了修饰后的产物的红外图谱，图形基本重合。在常温中性，35min的反应时间，4.8mL和5mL三氯氧磷量的条件下，修饰银耳多糖降解产品，得到了较大量的具有磷酸基团并具有抗氧化活性的产品，当溶液旋转蒸发最后剩余20～30mL时烘干制得产品，抽样检测为同一改性产品。由此，最终确定了改性的方法和工艺流程[8-11]。
另外，本实验还进行了降解后银耳单糖或低聚糖溶液pH调节的探索，发现应取pH7的条件。
本实验在脱色、弃渣取液以及旋转蒸发的过程中除去较多的杂质，以尽可能得到较纯的产品。
2.3 修饰后产物分子结构的测定
2.3.1 红外光谱图的测定 上曲线1为银耳多糖降解产物的红外光谱图，下曲线2是银耳多糖降解产物经过三氯氧磷改性后的红外光谱图。1和2比较，相同的功能团是3 721.26cm-1的峰为0-H的吸收峰；3 375.35cm-1的宽峰为0-H和N-H的伸缩振动，2 939.96cm-1为C-H的吸收峰，两峰是糖类的特征吸收峰；1 606.46cm-1的峰为-CHO的吸收峰；1 416.60cm-1的峰是-COOH的吸收峰，670.49cm-1的吸收峰分别对应图2的3 727.88、3 367.61、2 946.17cm-1和2 891.91、2 361.19cm-1和2 337.50、1 647.97、1 736.46、671.45cm-1和651.97cm-1的吸收峰[12]。
不同之处是1在852.02cm-1附近（包括789.92cm-1）处都有吸收，说明银耳多糖降解产物的结构中存在着α型糖苷键（即α端基差向异构体），而2则是有磷酸基功能团。通过这2张相似的红外光谱图的对比，我们可以发现这2种物质是为改性前后的物质，2比1增加了磷酸基官能团，有些物质的含量有所增减。由于银耳多糖是一种杂多糖，其酸降解后的产物是由多种单糖组成的[13]，上曲线和下曲线是由多种单糖构成的混合物的修饰前和修饰后的产物，并不是甘露糖的修饰前和修饰后的产物，因此，修饰前的产物具有甘露糖所没有的功能团。
2.3.2 银耳多糖酸解产品改性前后的红外图谱比较分析 通过曲线1和2的比较，可以从图1看出，将三氯氧磷化的银耳多糖酸解产品的红外光谱和银耳多糖酸解产品的红外光谱相比较，发现银耳多糖酸解产品经三氯磷酸化后，在1 059.62cm-1（v-C-O-C-）处连接上了一个磷酸基团，在1 135.81cm-1和984.06cm-1处组成一个磷酸双峰；在1 135.81cm-1处，磷酸基团双峰之一受1 059.62cm-1（v-C-O-C-）处的修饰前的-C-O-C-六元环和右侧糖甘键基团的拉动发生了少许偏移，磷酸双峰与图1原有基团彼此相互作用形成了一个大的吸收峰[14]。其中官能团相似的图谱之所以没有重合，可能是由于POCl3的作用。
图1 修饰前后产品比较
从上面的分析，可以看出，1比2多了个α型糖苷键，2则比1多了个磷酸基团。经多次产品红外分析，图谱重现性高。
2.4 修饰后产物抗氧化性的测定 本实验利用O-2清除剂能使邻苯三酚自氧化[15]产物在325nm处的吸收峰受到抑制这一特点，进行光化学方法测定。
由清除率的计算公式可以计算出修饰前后产物的清除作用的大小，通过比较可以发现4.8mL和5mL三氯氧磷用量的修饰后的产物的抗氧化活性明显高于修饰前的产物的抗氧化活性。表明修饰成功，具有实用意义。由表1可知，当三氯氧磷的用量为4.8mL时，其清除率比5mL时的要高，可能是因为当三氯氧磷过量时，多余三氯氧磷会继续与三氯氧磷化后的产物发生反应，使其变为另一种物质，导致一些含有磷酸基团的物质变成没有磷酸基团的物质，而降低清除率。 （下转38页）
表1 修饰前后产物的清除作用比较
[POCL3（mL）＼&摩尔浓度（mol/L）＼&清除率（%）＼&0＼&1＼&36.36＼&4.8＼&2＼&68.18＼&5＼&3＼&54.54＼&]
通过以上的比较分析，可以证明银耳多糖酸解产品经三氯磷酸化后，增加了磷酸基团，抗氧化活性有了较大的提高[13]。经多次实验，产品的抗氧化性能均较好。
通过红外图谱分析和抗氧化的研究结果分析，可以得出如下结论，使产品具有抗氧化功能的基团是磷酸基团，而并不是其他功能团。
3 结论
3.1 酸降解银耳多糖的最佳条件 本实验表明酸降解产生单糖或低聚糖在80℃、2h水浴，盐酸浓度约15.8%的条件下，银耳多糖的得率最高。
3.2 银耳多糖酸降解产品的POCl3化方法 通过实验可以得出：在常温中性条件下，POCl3用量4%～5%，反应时间20～35min，旋转蒸发溶液只剩20～30mL时，得到银耳多糖酸解出的产品都具有磷酸基团。
3.3 银耳多糖酸降解产品的抗氧化性 本实验通过邻苯三酚自氧化法对磷酸化修饰后产物的抗氧化作用进行了研究，通过清除率的分析发现，修饰后产物的抗氧化作用较修饰前有较明显的提高。
4 展望
本实验是通过银耳多糖降解产品在修饰前和修饰后的基团的变化情况，来判断出有无修饰上磷酸基团的。如果能够得到它的完全纯化样品，则可通过质谱分析，得出其分子式，结合红外光谱解析的计算方法，得出饱和度，从而用于产物结构的判断。
通过实验，我们看到银耳多糖修饰后的产物具有良好的抗氧化性，在生命科学领域具有很好的应用前景，对于药物、保健品的开发具有积极的意义。
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