—α通过PKCα信号通路诱导人系膜细胞IP3R1表达'> TNF—α通过PKCα信号通路诱导人系膜细胞IP3R1表达

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【摘要】目的 探讨肿瘤坏死因子（TNF-α）对人肾小球系膜细胞（HMCs）Ⅰ型1，4，5-三磷酸肌醇受体（ip3r1）蛋白和mRNA表达的影响及其分子机制，以期为肝肾综合征（HRS）肾小球滤过率下降的发生机制和防治思路提供理论依据。方法 用实时定量PCR和免疫印迹法检测tnf-α刺激HMCs 0、2、4、8、24 h的IP3R1mRNA和蛋白表达的情况。以TNF-α刺激HMCs 8 h为对照，应用D609，U73122，PP1，Safingol和Rottlerin预处理HMCs后，实时定量PCR法检测TNF-α对IP3R1mRNA表达的影响；以TNF-α刺激HMCs 24 h组为对照，免疫印迹法检测上述抑制剂预处理后，TNF-α对IP3R1蛋白表达的影响。此外，应用非放射性测活法检测0、4、8、24 h TNF-α对PKC-α的活化影响，并予D609、Safingo干预后，检测TNF-α对PKC-α的活化的影响。结果 TNF-α刺激HMCs 2 h到8 h IP3R1mRNA表达明显增加，于8 h达高峰（P＜0.01），而于24 h有所下降（P＜0.01）；而IP3R1蛋白表达于TNF-α刺激4 h开始升高，至24 h IP3R1蛋白升高达高峰（P＜0.01）。与8 h组比较，抑制剂+TNF-α各组中，Safingol+TNF-α组和D609+TNF-α组IP3R1mRNA的表达明显下降，差异具有统计学意义（3.30±0.81） vs. （1.95±0.13），P＜0.05；（2.10±0.49），P＜0.01。与24 h相比，Safingol+TNF-α组和D609+TNF-α组，IP3R1蛋白的表达亦明显下降（3.09±0.13 ）vs.（1.86+0.39），P＜0.01；（1.98±0.02），P＜0.01。非放射性测活检测显示TNF-α处理8 h使PKC-α自动磷酸化而活化，而D609或Safingol预处理后，可抑制TNF-α对PKC-α的活化。结论 TNF-α能上调IP3R1 mRNA及蛋白的表达，PC-PLC/PKC-α信号途径可能在TNF-α上调IP3R1的表达中起重要作用。

【关键词】肿瘤坏死因子-α；肝肾综合征；人肾小球系膜细胞；Ⅰ型1，4，5-三磷酸肌醇受体；蛋白激酶C-α；磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C

PC-PLC/PKC-α pathway involves in TNF-α-induced IP3R1 expression in human mesangial cellsWANG Yu-rong， ZHANG huan， SUN Hui， LIU Pei. Department of Digestion， Jiujiang First People Hospital， Jiujiang 332000， China

Correspoding author： WANG Yu-rong，Email：

【Abstract】Objective To explore the effects of TNF-α on the expression of IP3R1 mRNA and protein in human mesangial cells （HMCs） and elucidate the mechnism of TNF-α indnces the IP3R1 expression in the occurrence of hepatorenal syndrome （HRS）. Methods HMCs was stimulated by tumor （TNF-α） with 100 ng/mL for different hours （2， 4， 8， 24 hours ）. The expression change of IP3R1 mRNA and protein were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction and immunoblot assay. Several inhibitors including D609，U73122，PP1，Safingol， Rottlerin and non-radioactive PKC assay to examine the mechanism of signal transduction of TNF-α-regulated IP3R1 in HMCs. ResultsThe levels of IP3R1 mRNA at 2 h post-TNF-α exposure were significantly enhanced and reached peak at 8 h in HMCs（P＜0.01）， then descened at 24 h（P＜0.01）. The levels of IP3R1 protein at 4 h post-TNF-α exposure were obviously increased and reached peak at 24 h post-TNF-α exposure（P＜0.01）. Compared with the control group， safingol （PKC-α inhibitor） and D609 （PC-PLC inhibitor） each significantly suppressed TNF-α-induced expression of IP3R1 mRNA（3.30±0.81） vs. （1.95±0.130，P＜0.05；（2.10±0.49），P＜0.01 and IP3R1 protein（3.09±0.13） vs. （1.86+0.39），P＜0.01；（1.98±0.02），P＜0.01. TNF-α promoted autophosphorylation， and hence the activation， of PKC-α with maximal phosphorylation that occurred 8 h post-stimulation measured by non-radioactive PKC assay， and the effect was marked attenuated by pretreated with D609 or safingol. Conclusions TNF-α increased the expression of IP3R1 and this was mediated， at least in part， through the PC-PLC/PKC-α signaling pathways in HMCs.

【Key words】TNF-α； Hepatorenal syndrome； HMCs； IP3R1； PKC-α；PC-PLC

肝肾综合征（Hepatorenal syndrome， HRS）是各种原因导致的重症肝炎，肝衰竭等伴发的严重并发症，病死率高达80%。目前，认为肾小球滤过率（GFR）下降是HRS的主要发病机制 ［1-2］。已证实作为肾脏功能最活跃的细胞——肾小球系膜细胞的收缩活动可通过减少肾小球毛细血管袢数量来减少肾小球血流量和肾小球滤过面积和滤过系数，对GFR的下降具有重要作用［3］。而迄今国内外尚无涉及与HRS肾小球滤过率降低直接有关的系膜细胞内分子信号机制的研究。IP3R是胞内钙贮库， IP3R与三磷酸肌醇（IP3）结合后发生构象改变，导致通道开放，内质网中的储备钙被释放到细胞质中， 胞质游离Ca2+浓度升高引起细胞收缩［4］。国内外研究表明高表达的IP3R1介导Ca2+的失衡和细胞收缩敏感性增加，与许多疾病如房颤和哮喘、阿尔茨海默及帕金森氏病进展密切相关［5-7］。体外实验表明TNF-α可上调IP3R1表达［7］。而TNF-α与重型肝炎发生发展密切相关［8-9］。HRS时TNF-α可能通过上调IP3R1表达，为胞内IP3提供足够的IP3R，促进胞内Ca2+释放，增加肾小球系膜细胞收缩，导致GFR下降，进而促进HRS的发生与发展。为进一步验证笔者的假设，本研究以人肾小球系膜细胞（HMCs）为研究对象，探讨TNF-α对IP3R1基因及蛋白的影响，并深入探讨TNF-α诱导IP3R1蛋白表达的相关信号通路。希望能在揭示肝肾综合征肾小球率过滤下降的分子机制方面有所突破，并为干预肝肾综合征发生发展的新策略提供理论基础与作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

人肾小球系膜细胞（HMCs）和人肾小球系膜细胞专用培养基（MCM）（4201）sccience cell USA；TNF-α，R&D USA；兔抗人Ⅰ型IP3R抗体Chemicon International， 加拿大；PP1、rottlerin、U73122、D609、Safingol， Calbiochem， USA；pepTag non-radioactive pkc assay， promega USA；引物合成，逆转录试剂盒ExScriptTM RT Reagent Kit、PCR试剂盒SYBR?premix EX TaqTM（TaKaRa），日本Takara公司。

1.2 细胞培养，分组及处理

应用MCM将原代HCMs细胞在37 ℃，5% CO2恒温培养箱中进行培养，适时换液，消化传代，取4～8代细胞做后继实验。待细胞生长到约 80%～90%融合时，吸弃旧培养基，换成无血清（free serum medium，FSM）MCM同步饥饿 24 h后继续加药处理。

不同细胞模型分组：（1）分为不同时间（0、2、4、8、24 h）组，TNF-α（100 ng/ml）刺激HMCs，实时定量PCR和免疫印迹检测IP3R1mRNA和蛋白表达；（2）多种信号抑制剂预处理HMCs分组：①TNF-α处理0 h组；②TNF-α处理8 h组、24 h组；③U73122/D609/Rottlerin /Safingol各自单独处理组；④TNF-α+抑制剂组。［（PI-PLC）磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C特异性抑制剂） ］U73122 （5 μmol/L），［〔PC-PLC〕磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C特异性抑制剂］ D609 （50 μmol/L），非受体型蛋白酪氨酸激酶选择性抑制剂）PP1（10μmol/L），Rottlerin （PKC-δ特异性抑制剂） （5 μmol/L），（PKC-α特异性抑制剂） Safingol（5 μmol/L ）预先处理血清饥饿的HMCs 1 h后，再予TNF-α刺激8 h或24 h。（3）非放射性PKC测活分为TNF-α处理0，4，8，24 h组及TNF-α+D609，TNF-α+Safingol组，检测PKC活性的变化。

1.3 实时定量PCR

细胞总RNA提取，反转录为cDNA。采用SYBR Green I 荧光染料嵌合法，分别制作目的基因目的基因（IP3R1）和管家基因（3-磷酸甘油醛脱氢酶，GAPDH）的标准曲线。检测各实验组中IP3R1目的基因的相对表达量。引物：IP3R1 -F：5’-ACAGGGTTTCGCCATGTTGAC-3；IP3R1-R：5’-AGGCTCAGTGGCTCATGCCTA-3’；GAPDH-F：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’；GAPDH-R：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。IP3R1/GAPDHmR

NA的相对表达量=IP3R1基因拷贝数/GAPDH基因拷贝数，校正结果以T0 h为1，其余组与之比较。

1.4 Western印迹

提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜后加一抗孵育过夜；加二抗室温孵育2 h；TBST洗膜3次，ECL发光法检测。以相对分子质量45 000的β-actin作为内参，应用数码凝胶成像软件分析。目的蛋白质量浓度=目的蛋白灰度值/同一样本β-actin灰度值。

1.5 PKC活性检测

按pepTag?non-radioactive PKC assay操作说明于冰上建立反应体系：即在1 ml离心管中（含特异性PKC-α纯化蛋白），分别加入PKC reaction 5×buffer 5 μl， C1 Peptide 5 μl，超声乳化的PKC activator 5×solution（1 mg/ml磷脂酰丝氨酸）5 μl，Peptide protection solution 1 μl，30 ℃水浴反应30 min，95 ℃灭活10 min，加1 μl 80%甘油，0.8%琼脂糖-50 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）灌胶，将梳子置于胶的中央，以利于活化带与非活化带分别向阳极和阴极移动。电泳液为50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），100 V电泳15 min，紫外灯下数码凝胶成像并分析，进行组间比较。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0软件分析，计量资料以均值±标准差（x±s）表示，计量资料各组间的比较采用方差分析，以P

2 结果

2.1 TNF-α对IP3R1 mRNA和蛋白表达的影响

实时定量PCR检测结果表明，100 ng/mL的TNF-α处理HMCs 2 h后即可观察到IP3R1 mRNA表达上调，于8 h达高峰（P＜0.01），而在24 h 有所下降（P＜0.01），见表1。Western检查结果表明，100 ng/mL的TNF-α处理HMCs 4 h后即可观察到IP3R1蛋白表达的上调，至24 h IP3R1蛋白升高达高峰（P＜0.01）见图1，表2。

2.2 多种信号抑制剂对TNF-α诱导IP3R1mRNA和蛋白表达的影响

实时定量PCR检测结果表明，8h组与0 h组比较，IP3R1mRNA的表达明显增加（P＜0.01）；各种抑制剂单独处理HMCs后检测IP3R1mRNA表达的相对定量结果，显示IP3R1mRNA的表达与0 h组比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明了这些抑制剂对IP3R1mRNA基线表达水平无明显影响，见表3。与8h组比较，抑制剂+TNF-α各组中，Sa+T组和d609+T组IP3R1mRNA的表达明显下降，差异具有统计学意义［（3.30±0.81 ）vs. （1.95±0.13），P＜0.05；（2.10±0.49），P＜0.01］，见表3。而在其他抑制剂+T组：U+T，PP1+T，Rot+T组，IP3R1 mRNA的表达无明显变化（P＞0.05）见表3，表明Safingol和D609可阻断TNF-α对IP3R1 mRNA表达的上调， 说明PC-PLC和PKCα可能参与人系膜细胞中TNF-α上调IP3R1mRNA的表达。免疫印迹结果与实时定量PCR结果是一致的，与24 h相比，在Safingol和D609预处理组，IP3R1蛋白的表达明显下降［（3.09±0.13） vs. （1.86+0.39），P＜0.01；（1.98±0.02），P＜0.01］，见图2，表4。表明Safingol和D609可阻断TNF-α对IP3R1蛋白表达的上调，进一步说明PC-PLC和PKC-α参与了系膜细胞中TNF-α促进IP3R1蛋白的表达。

2.3 PKC-α活性检测

TNF-α处理0、4、8、24 h各组在阳极均可见特异性比较微弱的磷酸化条带；而TNF-α处理8 h磷酸化条带密度及宽度明显增强。说明TNF-α处理8 h，PKC-α的活化最强。而D609或Safingol预处理后，与8h组比较，PKC-α磷酸化条带明显减弱。表明D609 和Safingol可阻断TNF-α对PKC-α的活化。

3 讨论

IP3R是对第二信使IP3应答的一种普遍存在的胞内Ca2+释放通道，它在调节如受精、细胞收缩、增殖、神经信号传递等多种生物细胞功能活动中发挥重要作用。肾脏IP3R1主要存在于肾小球系膜细胞、血管平滑肌细胞［10］ 。

研究表明，胞内IP3R1表达增加，可能与房颤和哮喘及阿尔茨海默及帕金森氏病发病机制密切有关［5-7］；Wen等［11］和王静艳等［12］发现在肝硬化动物模型中，肾小球系膜细胞和入球小动脉平滑肌中IP3R1表达明显增加可能与肾脏低灌注有关［11-12］；而转化生长因子β下调IP3R1而降低GMCs和肾脏平滑肌的敏感性，与糖尿病肾脏低灌注进而发展成糖尿病肾病直接相关［13］。以上资料表明 IP3R数目和结构的变化可能会影响细胞内Ca2+信号的幅度和频率，将会导致细胞收缩功能紊乱。因此认为肾脏IP3R1表达的多少可能与肾脏对缩血管物质的敏感性有着密切联系，进而参与HRS发生与发展。

重型肝炎尤其伴有严重并发症患者的血清中TNF-α mRNA和蛋白明显增加［8］，系膜细胞在肾脏疾病中不仅是主要的靶细胞，也是病变过程的主要参与者。本实验中，首先应用实时定量PCR方法和免疫印迹法，从基因和蛋白水平验证了TNF-α可上调HMCs的IP3R1表达，这与国内动物实验及国外学者在神经元细胞中研究结果是一致的［7］。IP3R1 mRNA在时相上首先出现表达的明显升高，可能是TNF-α首先作用的靶位置，因此是IP3R1蛋白表达增加的始动因素。

系膜细胞中，蛋白酪氨酸激酶（PTK）、磷脂酶C（PLC）、PKC是TNF-α信号通路中重要的信号分子，参与TNF-α诱发多种基因的表达，TNF-α可活化系膜细胞PKC-α，PKC-ε和PKC-ζ及血管平滑肌和内皮细胞PKC-α和PKC-β［14-15］，而PKC的活化与磷脂酶C（PLC）有密切相关，PLC分解膜磷脂产生DAG，可活化PKC［16-17］。为进一步探究在它们是否参与系膜细胞TNF-α促进IP3R1蛋白的表达，选用了PKC、PTK、PLC等信号蛋白的特异性化学抑制剂，初步判断它们是否参与TNF-α上调IP3R1的表达。以上各种抑制剂的浓度在文献中是安全剂量［14-16］，对细胞活性没有明显影响并能有效抑制相应激酶活性。实验结果示D609和Safingol预处理HMCs，可显著抑制IP3R1 mRNA和蛋白的表达，表明PKC-α和PC-PLC参与了TNF-α诱发IP3R1表达的信号通路，但同时发现D609和Safingol预处理HMCs，并未完全抑制IP3R1蛋白的表达，大约抑制了40%。因此，TNF-α上调HMCs中IP3R1蛋白表达的信号通路中，是否可能存在其他的信号途径调节IP3R1蛋白表达？目前尚不清楚，还有待于进一步实验研究。

非放射性测活技术进一步证实了活化的PKC-α在TNF-α上调IP3R1表达的信号通路中关键作用。非放射性测活表明了TNF-α在8 h最大化活化PKC，而D609可阻断PKCα的活化，说明了D609是PKC-α的上游信号分子。这与多数研究结果即TNF-α经由PC-PLC途径活化PKC-α是一致的［18］，研究表明，TNF-α通过活化PC-PLC产生DAG进而活化PKC-α，TNF-α活化PKC的主要机制是通过TNFR1受体的胞内特定部位，即接头蛋白FAN，活化PC-PLC，PC-PLC水解细胞膜磷脂酰胆碱生成胆碱和DAG进而促进了PKC活化［19］。

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（收稿日期：2012-10-07）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.02.010

基金项目：江西省卫生厅科研基金资助项目 （20123192）

作者单位：332000 江西省九江，九江市第一人民医院消化内科（王育蓉、章欢、孙辉）；中国医科大学附属院一院传染科（刘沛）

通信作者：王育蓉， Email：

P153-P157