液相色谱—原子荧光光谱联用检测小龙虾和鱼中不同形态砷的研究

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摘要：采用液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法联用用技术对淡水鱼、海水鱼以及小龙虾样品建立相应的形态砷分析方法并对其含量进行了测定。对色谱条件、载流、载气流速、蠕动泵速、提取条件等进行优化，明确了4种砷形态化合物的分离条件。指出了此方法具有操作简便、灵敏度高、准确度高、干扰少、简便、快捷、需要样品量少等优点，可以对小龙虾和鱼样品中的砷形态进行定量分析。

关键词：液相色谱-原子荧光联用；小龙虾；淡水鱼；海水鱼；砷形态分析

中图分类号：X830文献标识码：A文章编号：1674-9944（2013）10-0160-03

1引言

砷与人类的生活息息相关，是环境中一种重要的非金属元素。砷在自然界中的丰度排第20位，它存在于沉积岩和熔积岩中，自然界中主要与硫形成矿物形式[1]。砷在自然界中主要与硫形成矿物形式。每年生产的将近一半的砷用于农药和木材防腐剂，其他少量用于生产金属砷、特殊合金、催化剂、颜料以及用于玻璃工业中[2～4]。砷在海水鱼、淡水鱼、小龙虾以及各种水及陆生植物中主要以以下4种形式存在：一甲基砷酸、二甲基砷酸、亚砷酸盐、砷酸盐。目前，在环境和生物体中存在的砷化合物形态有50 多种。不同形态的砷其环境毒理学性质相差迥异，砷总量的测定已经不能够充分反映砷化合物的环境健康效应[5，6]，所以对不同形态的砷含量进行分析是很有必要的。

元素的毒性和生物重要性都依赖于其化学形态[7]，不同形态的砷毒性相差甚远。在主要的砷化物中，亚砷酸盐和砷酸盐毒性大，而MMA和DMA毒性小，AsB和AsC则被认为没有毒性。亚砷酸盐、砷酸盐、MMA、DMA、AsB和AsC对实验小鼠的半数致死量LD50 （mg/kg）分别为14、20、700～1800、700～2600、>10000、>6500[8]。这些数据表明，无机砷对人体的毒性较大而甲基化的砷的毒性较小，AsB和AsC一般被认为是无毒的[8]。由于不同的砷化物的毒性不同，不同形态砷的致毒和去毒机理是由其在人体的转变决定的。砷在人体的代谢过程一般为AsⅢAsⅤMMADMA尿排出，AsB在体内不经过任何转变就排出[9]，从转化的顺序可得出AsⅢDMA是体内主要去毒的过程。在致毒方面，砷酸盐由于其结构类似，在ATP形成过程中可取代磷酸盐而破坏磷酰化作用[10]。而亚砷酸盐通过阻止含邻位疏基的酶在活性中心而表现出急性毒性[11]。砷中毒可引起黑脚病，严重的可以导致癌症。砷被认为在人体内有蓄积倾向[12]，是致癌、致畸、致突变的因子[13]。随着工业化程度的日趋加快，砷的污染日益加剧，对人类的威胁日趋严重。其污染主要来自饮用水、食物中的农药兽药残留和燃烧高砷煤等。由此可见研究食品中不同形态的砷的意义重大。

目前对食品中砷形态分析方法有很多，有光谱分析法、色谱法、毛细管电泳法。但目前主要采用联用技术，其中高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱法（HGAFS），因其成本低，分析灵敏度高，已成为一种有效的联用检测方法，用于检测食品中不同形态砷含量。由于各类食品的基质差异大，样品提取的条件不同，本文针对淡水鱼、海水鱼以及小龙虾样品，采用液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法连用技术建立相应的形态砷分析方法。

2实验部分

2.1材料和仪器

2.1.1仪器

SA-10形态分析仪（北京吉天有限公司）；涡旋震荡仪；纯水机（Barnstead）；himac高速冷冻离心机（日立）；吹氮浓缩仪。

2.1.2试剂和材料

硼氢化钾（KBH4）、氢氧化钾（KOH）、磷酸氢二铵（（NH4）2HPO4）、盐酸、甲醇（色谱纯）、硝酸（色谱纯）、亚砷酸根（标准物质，GBW08666）、砷酸根（标准物质，GBW08667）、一甲基砷（标准物质，GBW08668）、二甲基砷（标准物质，GBW08669）、水（18.2 MΩ·cm），滤膜：0.45μm。

2.2实验方法

2.2.1仪器条件

色谱柱 阴离子交换柱Hamilton PRP-X100（250 mm×4.1mm i.d.，10μm）；流动相：磷酸氢二铵溶液（15mmol/L，用盐酸调节pH值至6.0）；流速：1mL/min；进样体积：100μL；还原剂：1.5%KBH4和0.5%KOH；载流：7%HCl；形态分析仪泵速：70r/min；氢化物发生原子荧光光谱仪条件：灯电流：100mA；负高压：270V；载气流量：300mL/min；屏蔽气流量：600mL/min；辅阴极电流：30mA。

2.2.2样品处理

砷形态处理：称取经粉碎、混合均匀的样品5g（精确至0.01g）于50mL的离心管中，加10mL 50%甲醇溶液，涡旋震荡均匀之后，70℃超声萃取15min，15000r/min离心15min，取其上清液于25mL的比色管中，将其沉淀重复上次萃取1次，合并两次上清液，用流动相定容至25mL，取其上清液用滤纸过滤，取滤液的上清液5mL，于70℃下吹氮浓缩1.5mL，冷却后用流动相定容至2.5mL，再用过滤膜过2次膜。同时做试剂空白。

2.2.3精密度实验

配制0.010mg/L、0.050mg/L和0.100mg/L的3种不同浓度的混合标准溶液，分别进样5次，考察其精密度。结果表明，As（Ⅲ）、As（V）、DMA、MMA测定结果的相对标准偏差（RSD）均小于5%。

3结果与讨论

3.1色谱条件的选择

流动相的pH值与混合标准溶液砷形态的分离有关，选取流动相pH值为4.0、6.0、9.0来考察其对分离结果的影响，在pH4.0时，As（Ⅲ）和DMA两峰出现重叠；pH值为9.0时，DMA、MMA分离度下降，并出现严重拖尾现象；在pH值为6.0时，4种形态砷物质均能完全分离，且峰形较好，因此流动相pH值选取6.0。

3.2载流条件的选择

选取盐酸浓度1%、3%、7%来考察其对结果的影响，HCl浓度越大砷的荧光响应值越大，但基线不稳，噪声较大。故有实验得当HCl浓度为7%时噪声较小且能够提供较大的响应值。

3.3载气流速的影响

选取载气流速200、300、400mL/min来考察其对信噪比的影响。当载气流速在200mL/min时，信噪比较高，灵敏度较高，但背景干扰也较大，稳定性低。载气流速在400mL/min时，由于载气流速过大导致待分析物质被稀释，灵敏度较低。流速为300mL/min时，灵敏度和稳定性均较适宜，故载气流速选择300mL/min。

3.4蠕动泵速的影响

选取蠕动泵速60、70、80r/min来考察其对结果的影响，泵速改变会使经色谱柱分离后的砷与还原剂和载流反应的速度发生改变。泵速越大，氢化反应越完全，其灵敏度也越高，但当泵速达到80r/min后，较70r/min而言，其灵敏度没有明显的提高，而且泵速越高还原剂与载流消耗的量也越大，容易造成试剂的浪费，故综合以上分析选取蠕动泵速为70r/min。

3.5提取条件的影响

3.5.1提取剂对四种形态砷的含量的影响

（1）选用的超纯水和甲醇与水（1∶1）两种提取剂。由以下数据可以表明用甲醇与水（1∶1）和超纯水作为提取剂时，甲醇与水（1∶1）作为提取剂时的回收率要高于超纯水，故在提取样品时选用甲醇与水（1∶1）作为提取剂（表1）。

3.7方法的加标回收

本方法对6个样品进行四种不同形态砷的加标回收实验，所取的样品本底值很低。采用0、20、80μg/kg低中高的3个浓度进行实验。所得数据如表6，回收率在70%～120%。

4结语

本文采用液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法连用技术对淡水鱼、海水鱼以及小龙虾样品建立相应的形态砷分析方法，对色谱、光谱条件和提取条件进行优化。选用50%甲醇，70℃超声提取，70℃氮吹浓缩来提取样品中的砷的4种形态。

在对海水鱼、淡水鱼、小龙虾的砷的形态分析时得出：海水鱼和虾中亚砷酸根的含量较高，而砷酸根、一甲基砷、二甲基砷的含量几乎没有。在淡水鱼中刁子鱼中一甲基砷的含量较高，而胖头鱼和鲇鱼中亚砷酸根和砷酸根的含量较高，其他淡水鱼的含量很少。这些可能与海水鱼、虾中的亚砷酸根的稳定性和富集作用有关。

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