热处理对大鼠骨骼肌内质网应激的影响及对骨骼肌适应性的保护作用

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摘 要：为了研究热处理对大鼠骨骼肌内质网应激影响及对骨骼肌的保护作用，采用递增的热处理为研究手段，将SD大鼠被随机分成安静对照组（C）和热处理组（H），其中热处理组按照热处理完成后的时间再分为热处理即刻组（H1）、热处理24 h组（H2）、热处理48 h组（H3）和热处理6 d组（H4），每组8只。结果显示：热处理后H1、H2、H3组CK、LDH浓度都比C组低，但差异无显著性意义；热处理H2组SOD活性最高，与C组比较呈显著性差异（P

关 键 词：运动生物化学；热处理；骨骼肌；内质网应激；适应性保护；大鼠

中图分类号：G804.7 文献标志码：A 文章编号：1006-7116（2013）03-0130-04

研究证实，热应激能明显改善心肌缺血再灌注所受损伤[1]，机体细胞这种经历应激状态后改变细胞表型增强抵抗所受损伤的能力称之为预适应，这种热应激的保护作用与热休克蛋白的增加密切相关。内质网在受到长时间应激会发生内质网应激反应产生应激蛋白，对细胞发挥保护作用，其中某些应激蛋白属于热休克蛋白，如GRP78/Bip，因此推测热应激对机体的作用可能通过内质网应激反应来实现，而目前从内质网应激的角度去探讨热应激的文献非常少。本研究旨在从内质网应激的角度，研究热处理对大鼠骨骼肌内质网应激的影响，并从内质网应激的角度探讨热应激内源性抗损伤的适应性保护作用机制，为热应激处理在运动医学中的应用提供依据。

1 实验动物与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级雄性SD大鼠40只，平均体质量为（140.25±12.34） g，购自南方医科大学实验动物中心，置于温度为（22.0±0.3） ℃，湿度50%～60%下清洁级动物房中喂养，所有动物自由饮食、饮水。大鼠在适应性喂养3 d后随机分成对照组（C）（8只）和热处理组（H）（32只）。其中热处理组在热适应完毕后，再按具体宰杀时间进行分组：预处理即刻组（H1）、热处理24 h组（H2）、热处理48 h（H3）以及热处理后6 d（H4）组。

1.2 实验方案

热处理模型在参照Currie R W[2]和Diana A[3]热模型的基础上建立。本实验设定热处理的温度坚持以下原则，避免热处理时大鼠所受其他刺激的影响，采用非麻醉方式进行；保证大鼠热处理后不会因温度原因而死亡。大鼠置于恒温桑拿环境中加热，并监测肛温。热干预4 d为一个周期，3 d热处理，1 d休息。一共4个周期，热处理温度依次递增，湿度控制在50%，监测大鼠直肠温度达到预期值以后维持15 min。每次热处理总时间约为30～35 min。热处理期间，严格控制温度和湿度，并观察大鼠行为，整个热处理期间温度及湿度控制如表1。

1.3 动物取材

热处理大鼠在完成热处理后宰杀。宰杀时采用质量分数为7%水合氯醛（每100 g体重0.4 mL）腹腔注射麻醉。腹主动脉取血后放入抗凝管，分离血清后置于-70 ℃冰箱中保存待用；取血后进行腓肠肌分离，所得腓肠肌用4 ℃预冷的生理盐水清洗后用滤纸吸干，铝纸包裹置于液氮中保存。

1.4 测试方法

采用酶动力法并利用721分光光度计测试血清CK、LDH浓度，试剂由上海沪峰生物科技有限公司提供；采用黄嘌呤氧化酶法测试血清SOD，硫代巴比妥酸（TBA）法测试MDA，试剂由南京建成生物工程研究所提供，检测方法严格按照试剂盒所说明进行；GRP78测定通过蛋白免疫印迹Westen-Blotting检测，一抗由Santa Cruz Biotechnology公司提供，采用Image-proplus软件进行分析，并以靶蛋白条带积分光密度值（Integrated Absorbance，IA=平均光密度值×蛋白条带面积）除以β-actin条带积分光密度值的结果作为蛋白表达的相对水平。

1.5 实验数据统计

实验数据采用SPSS10.0软件包处理，实验结果以（ ±s）表示，采用两样本均数T检验分析，P

2 结果及分析

2.1 热处理对大鼠血清CK、LDH活性的影响

热处理后不同时相CK、LDH活性变化的结果显示，H1、H2、H3组的值都比C组低，H4组值高于C组，但各时相所测值与C组都无显著性差异（见表2）。

2.2 热处理对大鼠血清SOD活性及MDA浓度的影响

结果显示，热处理后H2组SOD活性最高，与C组比较呈显著性差异（P

2.3 内质网驻留分子伴侣GRP78在热处理后大鼠骨骼肌中表达的变化

采用GRP78特异性抗体进行免疫印迹检测，分别以β-actin蛋白条带IA值反映其表达水平。结果显示，热处理结束后H1组、H2组、H3组骨骼肌中GRP78的表达量较C组非常显著增加（P

3 讨论

机体在热应激下产生的反应是一种非特异性表达，生物体在高温刺激后都可产生应激反应，并产生热适应，以提高热耐受力，提高细胞抗损伤能力，因此热通常用来作为提高机体保护和耐受力的刺激因素。一次性的热刺激只提供暂时的保护作用，而长时间热刺激产生的保护作用持续时间长。研究表明，两个星期的热处理可明显提高机体在细胞、器官水平以及整体水平上的对氧化应激、长时间缺血以及耐热能力等其他应激的耐受能力[4-5]，这种保护作用可以维持终止热处理后3～4周，使热应激生物机体在某些功能上发生适应的改变，本实验方案中采用了两周左右的热刺激。

研究表明，机体细胞内质网的稳定对维持细胞功能起着重要作用[6]。机体在低氧、糖缺乏、自由基堆积和钙失衡等不利环境下会导致内质网应激，激活未折叠蛋白反应，使蛋白折叠能力提高、蛋白合成抑制，以适应不利应激[7-8]的刺激，并通过内质网应激蛋白GRP78、CHOP/GADDI53及ERP72等应激蛋白反映出来。GRP78属于内质网驻留蛋白，为特异性的内质网分子伴侣，是内质网应激的经典标志物。大量研究证明，热休克蛋白的诱导表达是介导缺血预适应、热处理、低氧预处理以及代谢预处理等延迟保护作用的关健的效应分子[9]，而内质网驻留蛋白GRP78与热休克蛋白中的HSP70家族具有高度同源性，因此属于热休克蛋白中的HSP7O家族。本实验中，大鼠在经过2周左右的热刺激后，H1、H2、H3组中的大鼠骨骼肌内质网驻留蛋白GRP78较安静对照组显著增加，内质网驻留蛋白GRP78的大量生成，预示大鼠在热应激过程中产生了内质网应激反应，以抵御热刺激对骨骼肌带来的不利影响，维护骨骼肌细胞功能的正常。

机体应激反应是细胞应激反应的综合体现，现已证实，内质网应激反应发生在线粒体应激和细胞核应激之前，是应激发生在细胞中的最初反应，并通过GRP78等特征蛋白体现[10]。GRP78属于葡萄糖调节蛋白，在应激反应调节时其基因的转录活性可提高10～25倍，表达量显著增高，通过表达上调可缓解内质网内未折叠蛋白负荷，并与内质网中错误折叠和未折叠蛋白结合，可以作为分子伴侣参与蛋白质的折叠和转运过程，从而恢复蛋白质正确结构，从而维持了内质网钙稳态及内环境的稳定[11]。有实验证明，生物体保护性预热应激后其体内热应激蛋白合成增加，并且应激蛋白的保护能力随着应激后恢复时间的推移而增强，且与HSP70高表达有关。当恢复到一定时间，动物获得最强的保护能力，此时组织的HSP70将达到高峰或是处于很高水平，而在此之后，保护能力又会随着HSP7O的下降而降低[12-13]。本实验中，在热适应结束后的48 h骨骼肌内质网驻留蛋白GRP78仍然处于很高的值也证实了这种保护能力。

研究表明，细胞具有内源性的抗损伤机制，帮助其从可逆性的损伤中恢复和适应，预防下一次损伤，适当的预热处理可以有效调动动物机体内的保护机制[14-15]，这种作用机制可能与抗氧化能力的变化有关，心肌细胞能够在热应激预适应后24～48 h内，通过改变细胞表型以抵抗随后的损伤，进行自我保护[16]并增加大鼠心肌抗氧化酶Mn-SOD表达[17-18]。除心肌外，肝脏及其他器官在热应激后也能获得抵抗随后氧自由基损害的能力[19]，并且这种能力与热休克蛋白有关。本实验热适应结束后H2组SOD活性最高，与安静对照组比较呈显著性差异，虽然H1、H3及H4组SOD活性与安静对照组相比都不呈显著性差异，但仍比对照组的值要高，同时H2组MDA浓度显著低于安静对照组，同时大鼠热适应后各时相血清CK和LDH活性比安静组低，表明大鼠在经过一段时间的预热适应后，机体的抗氧化能力得到了改善，提高对抗应激的能力。有研究发现，过度热应激可能给机体带来损伤，长时间高温会促使机体SOD活性降低，MDA浓度增加[20]，而本实验采取的热适应方案并没给大鼠带来骨骼肌等组织的损伤，可能是本实验大鼠热适应的温度不高、时间不长，并且热适应的温度逐渐提高，因而可能避免这一影响。

热适应处理能够有效调节动物器官组织和细胞的保护功能，表明机体内存有一个启动内源性保护机制的反馈通路，预热适应产生的作用主要通过细胞信号转导机制来完成。内质网应激是细胞内一种自我保护性应激机制的体现，与细胞内多种信号转导通路和调控有关。热环境下机体新陈代谢的加快，改变了细胞内环境状态，诱导细胞产生内质网应激反应，生成内质网应激相关蛋白，启动细胞应激反应信号转导通路，并可能通过反馈作用促进机体内源性抗氧化物酶蛋白的生成，增加抗氧化物活性，减少氧自由基的产生，阻止细胞损伤，增强细胞耐受力，同时激活机体的免疫机制，增强机体对外界损伤的抗御能力[21]。

本实验通过热处理使大鼠骨骼肌产生内质网应激反应并诱导大鼠骨骼肌功能发生适应性改变，同时增加了骨骼肌抗损伤能力，有利于骨骼肌的保护。由于内质网应激是维持细胞功能的重要手段，因此可以利用热适应提前诱导骨骼肌细胞产生内质网应激，从而提高骨骼肌细胞抵御未来不利环境的刺激，为从内质网应激的角度探讨运动性损伤的防治提供新的可能途径和依据。

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