提取方法及部位对三裂叶豚草基因组DNA的影响

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摘要：利用改良的CTAB法、SDS法及斑迹抽提法提取三裂叶豚草（Ambrosia trifida L.）不同部位的基因组DNA。结果表明，改良的CTAB法提取三裂叶豚草韧皮部基因组DNA的提取效果最好。

关键词：三裂叶豚草（Ambrosia trifida L.）；提取；基因组DNA；改良的CTAB法

中图分类号：Q943.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1447-03

三裂叶豚草（Ambrosia trifida L.）为菊科（Compositae）豚草属（Ambrosia）一年生粗壮草本植物，高50～120 cm，有时可达170～200 cm，叶掌状三裂，有时五裂，几乎全部对生[1]。三裂叶豚草原产于北美洲，生命力、竞争力极强，传播途径多，繁殖系数大，分布范围广，危害大，难以治理，对农业生产和生态环境已经造成了巨大危害[2-4]。2011年，本课题组调查时发现三裂叶豚草在辽宁、上海、黑龙江、吉林、北京等省市均有分布，并且在形态上有一定差异。三裂叶豚草分子水平的遗传变异研究可为探索其传播规律与途径提供一定依据。

本研究对三裂叶豚草基因组DNA提取方法及不同部位基因组DNA提取效果进行比较研究，为获取更高质量的DNA提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

三裂叶豚草成熟植株2011年10月采集自沈阳农业大学科研基地，取其叶片、茎、韧皮部、花序轴置于装有变色硅胶的密封袋中，干燥保存备用。

1.2 试剂

改良的CTAB提取缓冲液[5，6]：50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L EDTA，1.6 mol/L

NaCl，2% CTAB；SDS提取缓冲液[7]：50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% SDS；斑迹抽提缓冲液[8]：10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，2%SDS，0.039 mol/L二硫苏糖醇。

1.3 方法

1.3.1 样品的处理 称取0.015 g三裂叶豚草干燥叶片，放入研钵中加入石英砂和液氮研磨。将研磨后的粉末转移至2 mL离心管中，分别加入1 mL改良的CATB提取缓冲液和SDS提取缓冲液。斑迹抽提法的样品处理则不需研磨，直接将样品放入2 mL离心管中，加入斑迹抽提缓冲液。

1.3.2 基因组dna的提取 将2 mL离心管放入水浴锅中65 ℃水浴1 h，斑迹抽提法则需水浴3 h；1 200 r/min常温离心10 min取上清；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（体积比25∶24∶1）混合液，振荡混匀后，1 200 r/min常温离心10 min取上清；加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比24∶1）混合液并混匀，1 200 r/min常温离心10 min取上清，重复两次；加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，-20 ℃放置30 min，1 200 r/min常温离心10 min留沉淀；加入500 μL 70%乙醇洗涤3次；干燥2 h后加入100 μL TE缓冲液溶解DNA，放置于-20 ℃保存。试验均重复3次。

1.3.3 不同组织基因组DNA的提取 采用改良的CATB法分别提取三裂叶豚草的成熟叶片、茎、韧皮部、花序轴等组织部位基因组DNA，提取方法同“1.3.2”。试验均重复3次。

1.3.4 基因组DNA样品质量的检测 用紫外分光光度计检测提取样品的基因组DNA纯度，根据A260 nm/A280 nm判断DNA纯度；通过1%琼脂糖凝胶电泳检测提取样品的基因组DNA，并用紫外凝胶成像仪观察并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法提取三裂叶豚草叶片基因DNA的比较

用紫外分光光度计检测提取样品的基因组DNA纯度，根据A260 nm/A280 nm来判定DNA纯度。当A260 nm/A280 nm接近1.80时，DNA纯度较高，当A260 nm/A280 nm

2.2 三裂叶豚草不同组织部位基因组DNA提取结果的比较

利用改良的CTAB法提取三裂叶豚草成熟叶片、茎、韧皮部、花序轴的基因组DNA，经分紫外光光度计检测，A260 nm/A280 nm分别为1.82、1.87、1.86、1.89（表2）。利用此方法提取的不同组织部位基因组DNA质量均较好，韧皮部提取纯度稍高于其他部位；不同组织部位提取基因组DNA的抽提液颜色及沉淀后的DNA颜色有差异，成熟叶片与花序轴基因组DNA抽提液为深绿色，含酚类等杂质较多；茎基因组DNA抽提液颜色为绿色，含酚类等杂质相对较少；韧皮部基因组DNA抽提液颜色最淡，含酚类等杂质最少。

对不同组织部位提取的基因组DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测（图2）。结果表明，韧皮部基因组DNA无明显拖尾，DNA条带清晰，韧皮部提取质量高杂质少；茎和成熟叶片点样孔较亮，DNA有少量拖尾，茎和成熟叶片含杂质相比韧皮部较多，DNA质量稍差；花序轴基因组DNA条带较弱，也有少量拖尾，花序轴提取基因组DNA含量较少，杂质较多，质量最差。提取三裂叶豚草基因组DNA时，韧皮部最好，茎和成熟叶片稍差，花序轴效果最差。

3 小结与讨论

3.1 提取方法

本研究对CTAB法进行了改良，高盐能使DNA和多糖分离，使其较易析出[10]，相比普通CATB法，CTAB缓冲液中NaCl的浓度提高到1.6 mol/L。植物材料中普遍含有多酚类物质，容易氧化成棕褐色，与DNA结合形成不溶物，导致DNA纯度下降，不溶物一旦形成就很难去除。酚类化合物在植物材料中存在十分普遍，所以在抽提缓冲液中加入一定量的β-巯基乙醇[11]效果较为明显，但是过量的β-巯基乙醇能够使DNA断裂。经过重复试验，在1 000 μL缓冲液中加入25 μL β-巯基乙醇较为合适。

3.2 提取部位

植物提取基因组DNA的组织取材以幼叶效果最好。但是受限于季节和野外采样时间等因素影响，只能取到成熟叶片，成熟叶片次生代谢物质较多，提取到的DNA质量差。本研究对三裂叶豚草的其他组织（茎、韧皮部、花序轴）取样提取基因组DNA。韧皮部提取到的基因组DNA质量最好，茎、成熟叶片次之，花序轴最差。韧皮部提取的DNA沉淀为白色，易溶于TE缓冲液。琼脂糖凝胶电泳检测条带清晰，没有拖尾降解的现象，适合于代替幼嫩叶片作为基因组DNA提取组织材料。

本研究中采用三裂叶豚草鲜样提取基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带很弱或没有条带。采用干样效果较好，可能是鲜样中酶的活性很高，在提取过程中易使DNA降解，而干样细胞中含水较少，使酶的活性降低，甚至部分酶失活，于是研磨时释放出的酶对DNA的影响较小，并且干样容易在室温长期保存，方便在交通不便利的野外取样运输[12]。

参考文献：

[1] 关广清. 豚草和三裂叶豚草的形态特征和变异类型[J]. 沈阳农学院学报，1985，16（4）：9-17.

[2] 曲 波，吕国忠，杨 红.辽宁省外来入侵有害生物――杂草调查[J]. 沈阳农业大学学报，2006，37（4）：578-592.

[3] NORSWORTHY J K， PRASHANT J， LAWRENCE E， et al. Confirmation and control of glyphosate-resistant giant ragweed （Ambrosia trifida） in Tennessee[J]. Weed Technology and Competition，2010，24（1）：64-70.

[4] BRABHAM C B， GERBER C K， JOHNSON W G. Fate of glyphosate-resistant giant ragweed（Ambrosia trifida） in the presence and absence of glyphosate[J]. Weed Science，2011， 59（4）：506-511.

[5] DOYLE J J. A rapid DNA isolation procedure for small quantifies of fresh leaf tissue[J]. Phytochem Bull，1987（19）：11-15.

[6] 曹文波，郑璐璐，谢文海. 一种提取植物基因组DNA的方法――改良尿素法[J]. 华中师范大学学报（自然科学版），2008，42（3）：448-451.

[7] FARNHAM M W. Genetic variation among and within United States collard cultivars and landraces as determined by randomly amplified polymorphic DNA markers[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，1996，121（3）：374-379.

[8] 徐 立，余茂德，鲁 成，等.桑叶总DNA的斑迹抽提方法[J].蚕业科学，2005，31（1）：107.

[9] 张 丽，黄学琴，吴全忠，等.黑核桃叶片基因组DNA提取方法比较研究[J].中国农学通报，2011，27（28）：125-129.

[10] 马月萍，戴思兰.高盐沉淀CTAB法提取温室基因组DNA[J].生物技术通报，2009（7）：90-93.

[11] 秦艳玲，吴玉兰，李宗艳.改良CTAB法对西南牡丹总DNA提取工艺的优化[J].贵州农业科学，2011，39（11）：23-25.

[12] 吕 杰，马 媛，金 湘，等.硅胶干燥胡杨叶片DNA提取与RAPD反应体系的建立[J]. 北方园艺，2011（14）：131-134.