芪藤通络饮对实验性糖尿病周围神经病变大鼠的防治机制
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摘要：目的：探讨芪藤通络饮对糖尿痛周围神经病变大鼠(diabetic perineuralpathies，DPN)的可能防治机制。方法：链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠给予中药汤剂灌胃治疗，连续8周，观测体重、血糖、糖化血红蛋白的变化，观察药物对糖尿病大鼠坐骨神经形态学改变、用免疫组化的方法检测胰岛素样生长因子-1(IGF-1)在坐骨神经中的蛋白表达量。结果：中药组大鼠坐骨神经病变比模型组轻，轴突变性萎缩、髓鞘脱落较少，IGF-1在坐骨神经中的的表达与模型组相比显著性增高(P
中图分类号：R285.5
文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)12-2608-03
糖尿病周围神经病变(diabetic perineuralpathies，DPN)与糖尿病视网膜病变以及糖尿病肾病并称为糖尿病三大并发症。周围神经病变是糖尿病中最常见的神经病变，不但严重影响病人生活质量，而且造成巨大的经济和社会负担。其发生机理尚未完全明了，亦无特殊的治疗方法，随着神经分子生物学的发展，神经生长因子中胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)在神经再生中的作用越来越引起人们重视，IGF-1属神经营养因子，其结构、功能类似胰岛素。IGF-1与其受体结合后，能够激活酪氨酸蛋白激酶，通过一系列信号途径和基因表达发挥多种生物学作用。就神经系统而言，IGF-1可刺激并调节轴突、髓鞘的形成与再生，支持成熟神经元的存活，营养和保护各种神经细胞以促进其发育。近年来发现坐骨神经细胞中有IGF-1受体存在，推测ICE-1与糖尿病慢性微血管病并发症有一定关系。
芪藤通络饮选自《千家妙方》，根据临床经验加减，是由黄芪、鸡血藤等12味中药组成，具有益气活血、通络止痛之功效。临床应用中发现，该中药对糖尿病患者的一些外周神经并发症状如肢体感觉异常、麻木、疼痛等具有较为明显的改善作用。因此，笔者采用免疫组化的方法测定了经由中药芪藤通络饮干预的糖尿病及合并周围神经病变大鼠坐骨神经中IGE-1蛋白表达的变化，观察其与糖尿病周围神经病变的关系以及该中药对于糖尿病及合并周围神经病变的防治作用。
1.材料和方法
1.1实验材料
材料：Wistar大鼠，雄性，体重(200±14.5)g，大连医科大学实验动物研究所繁育场提供，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2002-0002。STZ(signm公司)；兔抗鼠IGF-1(北京博奥森生物技术有限公司)；SP kit(即用型)及DAB显色液(北京中杉生物技术有限公司)。中药芪藤通络饮由黄芪、黄柏、牛膝、鸡血藤、青黛等组成，以上生药经过常规水煎，滤过药液浓缩成lg/mL，由本院制剂室炮制。美国雅培血糖仪，Olympus AU-1000全自动生化分析仪，Olympus CH30显微镜。JEM-2000EX透射电子显微镜(日本JEOL公司)。RM2145石蜡切片机(德国Leiea)。
1.2实验方法
1.2.1STZ糖尿病走鼠模型的建立 健康雄性Wistar大鼠，适应性喂养5～7天，无不良反应后开始造模，随机取8只作为正常对照组，余均造模。大鼠禁食14h，将溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH4.5)配成1％的STZ液以60m/kg的剂量给大鼠1次性腹腔注射，72h后尾静脉取血，测定血糖，以血糖在15mmol/L以上，尿糖7～8者大鼠为造模成功鼠，第4和8周时复查血糖，血糖低于15mmol/L的大鼠予以剔除。造模后4周糖尿病大鼠出现明显的多发性神经病变。正常对照大鼠仅腹腔注射等体积的缓冲液(假造模)，并在假造模后72h、4和8周同上方法测血糖，以排除糖尿病。
1.2.2动物分组及给药 在试验72h后对造模大鼠利用随机数字表分两组，每组8只大鼠。(1)糖尿病模型组(DM组)：不予特殊处理，自由进食饮水。(2)冲药治疗组：中药生药水煎浓缩成lg/mL煎剂，按15mL/kg体重日1次灌胃，连续给药8周。另设(3)正常对照(NC组)组大鼠8只，不做处理。
1.2.3一般指标观察 动态监测动物体重、进食量、饮水量，分别于腹腔注射STZ前，注射STZ后72h、4周和灌药4周后用美国雅培血糖仪检测尾静脉FBG。第8周实验结束时眼角取血并肝素抗凝，采用奥林帕斯全自动生化分析仪检测糖化血红蛋白。
1.2.4神经取材及形态学观察 (1)神经取材。第8周末将大鼠用乙醚麻醉，快速用高温处理过的手术剪刀剖开股二头肌与半膜肌之间的皮肤，并沿两股间钝性分离。暴露并摘取坐骨神经，予4℃预冷的生理盐水反复冲洗后，滤纸吸干。取用一半立即置人10％中尔马林液固定，而后石蜡包埋，横断面切片，苏木素一伊红(HE)染色。另取一半坐骨神经切成若干小条立即置于2.5％戊二醛-PBS(PH7.4)中固定，脱水、包埋、超薄切片，用醋酸铀-枸橼酸铅双染色，以备在透射电镜下观察超微结构并拍照。
(2)免疫组织化学测定。坐骨神经石蜡包埋，横切面切片厚51μm，37℃烘干。参照试剂盒说明操作。常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化脱水、3％H2O2处理消除内源性过氧化物酶后，微波加热抗原修复18min、用0.01mol/L的PBS(pH=7.4)液漂洗后滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育15min，弃去血清，加入一抗为兔抗鼠1：500稀释的IGF-1抗体，于4℃孵育过夜，再与用生物素标记的羊抗兔IgG抗体，在37℃温箱中孵育15min，滴加SP，37℃温箱中孵育15min，用DAB液显色，镜下控制显色反应。以不加一抗作为空白对照。神经纤维轴突横断面出现特异性的棕黄色颗粒者为阳性，空白对照依旧为浅蓝色。在高倍视野(100 ×10)下观察，将镜下阳性轴突数同总轴突数相比较，得到阳性表达率。每张切片观察4个高倍视野，取其平均值作为阳性表达率。 1.2.5统计学处理 所有数据采以均数±标准差表示，用SPSS12.0统计软件对数据做处理，单因素方差分析方法统计，P
2.结果
2.1大鼠一般状况体重血糖及HbAle比较
实验期间，NC组大鼠一般状态良好；从第2周开始DM组大鼠“三多”症状逐渐明显，同时持续消瘦，精神萎糜，皮毛不荣，个别大鼠出现失明，足部溃烂、皮肤溃疡等现象，并有大鼠出现烦躁不安，步态不稳等中枢神经系统
功能障碍症状。治疗组大鼠进食，饮水，尿量明显减少，精神状态相对较好。实验前，3组大鼠体重没有明显差别(P>0.05)，实验4周及8周后，DM组及治疗组均有所下降，与NC组大鼠相比都有显著性差异(P＜0.05)，治疗组与DM组相比有显著性差异(p0.05)，但都显著高于NC组(P
2.2坐骨神经的形态学变化
光镜下NC组大鼠坐骨神经纤维排列紧密整齐，轴突髓鞘结构完整清晰，间质均匀淡染。DM组坐骨神经纤维排列紊乱，出现明显的神经损伤反应，神经纤维密度下降，可见脱髓鞘现象。轴突萎缩，被变性的髓鞘挤压成不规则型。治疗组坐骨神经纤维排列较规则，髓鞘脱失不明显，未见轴索萎缩，变性亦较轻。
电镜下NC组大鼠坐骨神经髓鞘板层结构清晰，神经原纤维排列规整，神经内微血管壁光滑，无管腔狭窄及血栓形成征象。DM组髓鞘板层结构不清，部分板层松散、断裂，髓鞘出现许多类脂变性的小凝块。神经原纤维排列紊乱，轴索微丝及微管断裂、溶解，神经内微血管管壁增厚，管腔狭窄，治疗组以上病变较轻。
2.3中药对大鼠坐骨神经IGF-1蛋白表达量的影响从免疫组化切片可以观察到，NC组坐骨神经组织中可有大量棕黄色IGF-1表达，主要分布于轴突及其周围，在髓鞘中也有少量表达。随病情程度加重，其表达量显著减少。其中NC组阳性表达率(81.10±8.06)％高于DM组(49.25±5.10)％，P
3.讨论
糖尿病周围神经病变属中医“血痹”、“脉痹”等病范畴，多数学者认为DPN以气虚血瘀，本虚标实为基本病机。临床及动物实验研究发现，瘀血为糖尿病神经病变的主要病理因素。因而治疗上应以益气、活血、化瘀为重点，使气旺血行，瘀去络通；麻木、疼痛等症状则自然缓解。益气活血化瘀中药芪藤通络饮具有抑制血小板凝集、扩张微血管、改善微循环，促进损伤神经组织的修复的作用。
现代药理研究表明，方中黄芪除能降糖、耐缺氧、镇痛、抗寒、抗疲劳作用外，尚能抑制醛糖还原酶及对细胞代谢、核酸代谢有良性调节作用。鸡血藤有镇痛、扩血管、抗凝血、抑制血小板凝聚、抗炎等作用。薏苡仁有解热、镇痛、降糖、抗缺氧、抗炎等作用。牛膝当中含有三萜皂苷，水解后生成齐墩果酸，有降低血糖，降低血胆固醇的作用。众药合方具有抑制血小板凝集、扩张微血管、改善微循环，促进损伤神经组织修复的作用，从而改善并提高神经功能。
笔者在实验中发现，DM组大鼠外周神经随着病情加重后可出现轴突萎缩、髓鞘改变等典型病理变化，而NC组未见此变化，中药治疗组以上病理变化明显减轻，这与以往研究结果相符。证明该方有良好的改善坐骨神经变性坏死、脱髓鞘等病理形态学变化的作用。 本实验免疫组化结果显示中药组IGF-1的阳性表达率均显著性的高于DM组；DM组大鼠血糖偏高抑制了IGF-1的合成及释放，阻断了GH(生长激素)对IGF-1合成的促进作用，中药芪藤通络饮降低了大鼠的血糖，使其接近正常值，从而部分解除了IGF-1合成受阻的缘故。坐骨神经损伤后，坐骨神经中IGF-1蛋白表达降低，通过补充外源性IGF-1可减轻糖尿病神经损害，提示ICF-1水平下降与DNP的发病有关，实验观察到大鼠病变的坐骨神经中IGF-1水平降低，符合以往研究。 大鼠坐骨神经损伤后经过中药芪藤通络饮干预，坐骨神经组织中IGF-1蛋白表达量显著提高，提示该中药能够促进内源性IGF-1表达继发性增加，这可能就是本中药防治DPN大鼠神经病变的机制之一，其他作用途径还有待进一步研究。