多种烟杆降解菌株的筛选及其协同作用比例优化

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摘要 为了对废弃烟杆再利用，自行筛选到几种能够利用废弃烟杆进行高温好氧堆肥的高效微生物菌株，对分解出的几种菌株进行初步检测并对菌株协同作用的组合和配比做了进一步试验。结果表明，筛选获得的3组降解烟杆纤维素的菌株均能在以烟杆为唯一营养源的培养基上生长，且具有较强降解纤维素的能力，菌株编号分别为H2568、B1、M1。对这3种菌株的协同作用试验显示，H2568、B1、M1以1.0∶1.0∶1.5的生物量比例组合时具有最强的降解烟杆的能力，其纤维素降解率、半纤维素降解率、木质素降解率分别达到了56%、70%、33%，最高纤维素酶活力达到625.44 U/mL。

关键词 烟草；烟杆；纤维素酶；协同降解作用

中图分类号 Q93 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）11-0225-03

Abstract In order to reuse the waste tobacco stalk，several microbial strains can use waste tobacco rod high-temperature aerobic composting were screened，preliminary detection of several decomposed strains was conducted，and the further testing for strains synergistic effect of the combination and proportion was carried out.The results showed that three groups of degradation of tobacco stalk cellulose strains can grow in the culture medium which with tobacco stems as the sole source of nutrition，and has strong cellulose degradation ability，number of strains were H2568，B1，M1.Synergistic test indicated when biomass ratios of H2568，B1，M1 with 1.0∶1.0∶1.5，combination with the strongest degradation of the cigarette rod ability，the degradation rate of cellulose，hemicellulose degradation rate，lignin degradation rate reached 56%，70%，33%，the highest fiber prime enzyme activity reached 625.44 U/mL.

Key words tobacco；tobacco stalk；cellulase；synergistic degradation

烟草不仅是一种极具经济价值的作物，而且也是具有科研价值的一年生模式植物[1]。我国的烟草种植量和生产量稳居世界首位，在烟草采收和运输的过程中，大量的烟杆会被放弃或焚烧，即污染环境又造成资源浪费[2-3]。如何再充分利用这些废弃烟杆，成为目前迫切需要研究解决的课题。杨政明[4]、詹其厚[5]、张从军[6]等利用烟杆中含有大量的氮、磷、钾及微量元素的特性，利用废弃烟草生产有机复合肥分别在核桃、夏玉米、水稻上施用取得了较好的肥效，并使农作物产量显著增加。但是又因烟杆中含有77.4%纤维素和半纤维素、18.63%木质素[7]，显著高于禾本科作物秸秆中木质素含量，因此其难以被充分利用[8]。张楠[8]、周熠[9]对烟杆中纤维素进行了降解并取得了不错的效果，但纤维素的降解率不到40%，理论上还有一定的提升空间。因此，本研究通过组合高效的好氧纤维素、半纤维素、木质素降解组合菌群，考察其对烟杆的降解效果并优化其组合比例，以便开发能够利用废弃烟杆制作高温好氧堆肥的高效微生物菌剂[10]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所有烟杆由中南烟草试验站提供。培养基：细菌培养基为0.5% NaCl，0.5%牛肉膏，1%蛋白胨，蒸馏水100 mL，pH=7；真菌培养基为综合PDA琼脂培养基（20%马铃薯提取液，2%葡萄糖，0.3% KH2PO4，0.15% MgSO4・7H2O，0.02%维生素B1，蒸馏水100 mL，pH=7）。烟杆选择培养基为10%烟杆，蒸馏水100 mL，琼脂粉2.0%，调pH值至7。烟杆液体发酵培养基为10%烟杆，蒸馏水100 mL，调pH值至7。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种初步筛选。从土壤、腐熟的烟杆、刚屠宰的牛的胃部以及实验室现有的纤维素降解菌中筛选能降解烟杆的菌种。将各菌株分别接种1环到2种种子液培养基扩大培养，培养温度分别为25、37 ℃，摇床转速为180 r/min，发酵24 h后，各取种子液0.1 mL涂布在烟杆选择培养基上，分别在25、37 ℃培养，3 d后观察菌种生长情况。选择能在烟杆选择培养基上生长的菌种进行下一步烟杆液体发酵试验。

1.2.2 不同菌株烟杆液体发酵试验。将各菌株种子液以10%的接种量接种到烟杆液体发酵培养基培养，发酵10 d后以4 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL适量稀释，用DNS法测定还原糖，选取还原糖含量较高的菌株进行下一步试验。

1.2.3 各菌拮抗性试验。将活力较高的菌株进行两两拮抗性试验，利用抑菌圈法在蛋白胨、牛肉膏培养基（37 ℃）和PDA培养基（25 ℃）上培养24 h后，观察菌株相互拮抗的情况。

1.2.4 不同组合菌烟杆液态发酵试验。将无明显拮抗性作用的菌株做三菌种组合和四菌种组合发酵试验，把混合种子液于37 ℃、180 r/min扩大培养24 h，按接种量10%的烟杆液体发酵15 d，测定发酵液中纤维素、半纤维素、木质素降解率，选出降解效率较高的4组菌种进行下一步试验。

1.2.5 组合菌酶活力与发酵时间的关系。将选取的最佳组合菌在37 ℃、180 r/min条件下进行烟杆液体发酵15 d，间隔测定发酵过程中的纤维素酶活力。

1.2.6 组合菌酶活力与发酵温度的关系。将选取的最佳组合菌分别在40、50、60 ℃及其他条件不变的条件下发酵11 d，测定纤维素酶活力，判断所选组合菌是否具有耐高温性。

1.3 分析方法

1.3.1 纤维素、半纤维素、木质素定量分析方法。通过测定还原糖的增加量可以初步挑选出更能高效降解烟杆的菌种，但是为了更详细地了解烟杆中主要成分的降解情况[11]，下一步试验以纤维素、半纤维素、木质素的降解率为主要试验指标[12]。图1为纤维素、半纤维素、木质素定量分析方法。

1.3.2 纤维素酶活性测定方法。取10 mL发酵液用离心机4 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL稀释25倍制成待测酶液。取4支25 mL刻度具塞试管（2支平行管、1支空白管）。分别向所有管中加入CMC-Na溶液2.00 mL，再加入稀释好的待测酶液0.50 mL（空白管不加），用漩涡混匀器混匀，盖塞。（50.0+0.1）℃水浴30 min后，加入DNS试剂3.0 mL，于空白管中加入待测酶液0.50 mL，摇匀。沸水浴10 min后，迅速冷却至室温，用水定容至25 mL，以空白管调仪器零点，在分光光度计波长540 nm下，用10 mm比色杯分别测量样品管中样液的吸光度，取平均值。通过用线性回归方程求出纤维素酶活[13]。

2 结果与分析

2.1 烟杆化学组成分析

首先对提供的样品进行了部分化学组成的检测，尤其是对于纤维素类的物质成分进行了定量分析。在提供的烟杆样品中，总纤维素含量达到77.44%，木素含量大约为18.63%，果胶含量为3.89%，苯-醇溶出物含量为3.21%，另外还有5%左右的灰分。可见，烟杆中含有丰富的纤维素类物质资源，如果能够对这些纤维素降解后加以利用，完全可以提高烟杆废弃物的利用价值。

2.2 纤维素菌的筛选

在筛选出来的微生物中有11组菌种能利用烟杆生长，将其分别编号为H2568、H1249、H1348、H1764、H4479、B1、M1、N1、Y1、Y2、Y3。进行下一步烟杆液体发酵试验以确定所需纤维素菌。

2.3 纤维素菌的确定

初步筛选的11组菌株在降解烟杆多糖生成还原糖的能力上差异较为显著。从图2可以看出，这些微生物生成还原糖的量从高到低的顺序依次为B1、M1、H2568、N1、H1249、H1348、Y3、H1764、H4479、Y2、Y1。选取其中降解能力最强的5株菌H1249、H2568、B1、M1、N1，作为下一步菌种协同降解作用的基础进行拮抗试验。

2.4 不同菌种拮抗结果

有很多试验研究表明，复合菌群较单一菌的降解能力强，特别是针对纤维素、木质素等需多种酶协同降解的物质，不同菌种组合起来可以起到补充和加强分解的作用。但在同一生长环境下，不同菌株之间产生拮抗性作用会抑制其自身生长和产酶活力。利用菌株之间不相容性，进行拮抗性试验，从表1可以看出：H1249与B1拮抗，选取相对降解能力更强的B1。得到所需的4株无明显拮抗性的菌株H2568、B1、M1、N1，可用于下一步菌种组合研究。

2.5 半纤维素、木质素和纤维素的降解情况

在多菌株协同降解试验中发现H2568、B1和M1这3种菌种以等量进行组合时能够取得较好的降解效果（图3），纤维素、半纤维素、木质素的降解率分别达到了47%、63%、26%。因此，对烟杆纤维素降解效果最为理想的协同菌群组合确定为H2568+B1+M1。

2.6 组合菌酶活力与发酵时间的关系

将上述试验中确定的最佳组合菌H2568-B1-M1烟杆液体发酵15 d[14]，观察其发酵过程中酶活力的变化情况（图4），发酵第11天时，发酵体系中纤维素酶的活力最高，达到625.44 U/mL，随后酶活力开始逐步降低。

2.7 组合菌酶活力与发酵温度的关系

高温对菌株的生长与产酶不利，但由于现阶段烟杆大多处理方式为堆肥，那么固态发酵所需升温过程不能避免，因此需要筛选出的组合菌能够耐高温来适应固态堆肥。从图5可以看出，在发酵11 d后，H2568-B1-M1的纤维素酶活不可避免的受到高温影响，但是即使在60 ℃下仍能达到250.47 U/mL。组合菌耐高温试验证明了H2568-B1-M1能长期保持较高的纤维素酶活力且耐高温。

2.8 菌量比例对协同降解作用的影响

确定H2568、B1与M1为最佳的菌种组合后，对其接种时的比例进行优化试验。从图6可以看出，H2568、B1与M1以1.0∶1.0∶1.5的比例组成烟杆发酵种子液时，取得了最佳效果。其纤维素降解率、半纤维素降解率、木质素降解率分别达到56%、70%、33%，较1.0∶1.0∶1.0配比时的降解能力显著提升。

3 结论与讨论

烟叶产量的增加同时产生了大量的废弃烟杆。由于烟杆不易腐烂也不能直接用于肥田，因而绝大部分都是作为废弃物被丢弃或焚烧，这不仅不同程度地污染了当地的生活生产环境，也造成了资源的浪费。经试验证明通过微生物发酵将烟杆中的大分子物质降解，将纤维素、半纤维素、木质素降解为小分子的单糖，使卷烟制造产生的废弃物转化为农业生产中急需的有机肥，具备广阔的生产应用前景。而烟杆中有机质的降解依赖于微生物是否产生多种酶系和产各种酶系活力的强弱。基于纤维素酶的复杂性，大量试验证明，复合菌液体发酵产纤维素酶活力高于单菌株，在同一生长环境下，相互依赖，共同生长，达到良好的协调作用。因此，筛选出无明显拮抗、耐高温、长时间具备高酶活且能高效降解烟杆的组合菌是试验的基础。在自然环境中常见的纤维素分解细菌大多为食纤维菌属、生孢食纤维菌属、多囊菌属、镰状纤维菌属与纤维弧菌属。具有很强的纤维素分解能力的真菌主要有木霉、镰刀霉、青霉、曲霉、毛霉、葡萄孢霉等属的菌种。本试验前期筛选了多种能降解纤维素的细菌、真菌用于进一步测试它们对烟杆的降解能力。因此，确定最佳的降解烟杆组合菌是为下一步研究提供了根本的基础。本试验中纤维素酶活力和还原糖的生成量能说明菌种自身降解能力的强弱，从另一角度总纤维素、半纤维素、木质素的变化情况反映了组合菌的降解效率。H2568-B1-M1以1.0∶1.0∶1.5的比例进行烟杆液体发酵，11 d后其纤维素降解率、半纤维素降解率、木质素降解率分别达到56%、70%、33%，说明经H2568-B1-M1产生多种酶系，促进了有机质的降解，对烟杆的降解取得了较显著效果，进一步提高纤维素酶活力，增加还原糖的生成量，提高纤维素、半纤维素、木质素的降解率，为进一步进行烟杆固体发酵奠定基础。

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