加味射干麻黄汤对支气管哮喘小鼠模型的影响
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摘要：目的：观察加味射干麻黄汤对哮喘小鼠模型血清中干扰素－γ(IFN－γ)和氧自由基的影响，探讨其作用机制。方法：将40只小鼠随机分组为正常对照组、哮喘组、中药组、西药组，每组10只。采用卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏和雾化激发的方法建立小鼠支气管哮喘模型，然后用不同的措施对哮喘小鼠模型进行干预。干预完成后，采用ELISA方法检测每只小鼠血清中IFN－γ水平，分光光度法检测小鼠肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量。并对各组小鼠肺组织进行病理形态学观察。结果：模型组与正常组相比。前者血清中IFN－γ水平显著降低(P＜0.01)；肺组织中SOD活性显著降低(P＜0.05)；伴MDA含量增高(P＜0.01)。中药组和西药组与模型组相比，前二者血清中IFN－γ水平则高于模型组(P＜0.05-0.01)；肺组织中SOD活性明显升高(P＜0.01)而MDA降低(P＜0.01)。正常对照组IFN－γ水平、肺组织SOD和MDA活性与中药组及西药组比较，无统计学意义(P＞0.05)；中药组IFN－γ水平、肺组织中SOD和MDA与西药组比较亦无统计学意义(P＞0.05)。结论：通过促进哮喘小鼠体内干扰素－γ表达，提高肺组织抗氧化能力，从而减轻气道免疫炎症、降低支气管高反应性可能是加味射干麻黄汤治疗哮喘的作用机制之一。
关键词：哮喘；射干麻黄汤；IFN－γ；氧自由基
支气管哮喘是一种气道的慢性炎症性疾病。是由多种炎症介质、炎症细胞和细胞因子参与的相互作用的结果。大量研究证实Th亚群失衡在哮喘发病过程中具有重要作用，表现为Tht功能相对抑制，Th功能相对亢进，导致炎性细胞浸润，这些炎性细胞聚集、激活过程中可产生大量的氧自由基，引发了脂质过氧化作用，加重炎症反应，造成肺组织损伤。因而纠正Th亚群失衡、减轻脂质过氧化反应已成为当今哮喘治疗的新课题。中医药在支气管哮喘的治疗方面历来有其独特的优势，本次实验采用方药是以张仲景《金匮要略》中咳喘治疗的代表方剂射干麻黄汤为基础加味而成，旨在观察IFN－γ和氧自由基在加味射干麻黄汤干预后表达水平的变化，来探讨其作用机理。
1 材料与方法
1．1材料与试剂健康、昆明种、普通级小鼠40只，雌性，体重18-22g。由辽宁中医药大学动物实验中心提供。加味射干麻黄汤每剂由射干15g，麻黄8g，教冬花15g，细辛3g，紫菀15g,地龙15g，五味子15g,半夏15g，生姜15g，大枣6枚，甘草15g等12味共161.5g(70kg为成人每日常规用量)生药组成，用蒸馏水1000mL，先煎麻黄5min，后人余药，共水煎2次，然后过滤，浓缩为混悬液220mL(每1mL含生药0.74g)。地塞米松片系浙江仙居制药有限公司生产，0.75mg/片，以蒸馏水配成0.12mg/mL药液。卵蛋白片由天津化学试剂厂生产；氢氧化铝由沈阳化学试剂厂生产；小鼠IFN－γ(ELISA)试剂盒购于深圳晶美生物工程有限公司；SOD试剂盒、MDA试剂盒及考马斯亮蓝蛋白试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
1．2 方法①40只小鼠随机分为4组，即正常对照组、哮喘模型组、中药干预组、西药干预组，每组10只。模型组、中药组、西药组小鼠均于实验第1、7、14天腹腔注射致敏药液0.5mL(OVA15μg，氢氧化铝2mg，加生理盐水致0.5mL)，于21天令小鼠雾化吸入1％OVA，每次30min，每天2次，共10天。模型组小鼠每次雾化前灌胃注入蒸馏水0.5mL/只，中药组小鼠每次雾化前灌胃注入加味射干麻黄汤煎剂0.5mL/只(给药按体表剂量系数换算)，西药组小鼠每次雾化前灌胃注入地塞米松药液0.5mL/只。正常对照组小鼠第1、7、14天腹腔注射生理盐水0.5mL/只，并于第21天开始令小鼠雾化吸入生理盐水，每天2次，每次30min，共10天，每次雾化前灌胃注入蒸馏水0.5mL/只。实验第3l天对各组小鼠行眼动脉采血处死，并离心取血清备用。右肺用4％甲醛固定后，常规石蜡包埋、切片，HE染色观察病理变化。左肺称重后匀浆制成10％悬液，离心取上清。②干扰素－γ和氧自由基物质检测：严格按照小鼠IFN－γ(ELISA)试剂盒说明书及SOD、MDA测定试剂盒说明书进行操作。
1．3统计学处理实验数据采用SPSS11.0进行统计学处理，结果以X±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05视为统计学有意义。
2 结果
2．1 小鼠血清IFN－γ及肺组织中SOD MDA的检测数值见表1。
模型组小鼠与正常组小鼠相比，前者血清中IFN－γ水平显著降低(P＜0.01)；肺组织中SOD活性显著降低(P＜0.05)，伴MDA含量增高(P＜0.01)。中药组和西药组小鼠与模型组小鼠相比，前二者血清中IFN－γ水平升高(P＜0.05―0.01)；肺组织中SOD活性明显升高(P＜0.01)而MDA降低(P＜0.05-0.01)。正常对照组小鼠血清中IFN－γ水平、肺组织SOD和MDA活性与中药组及西药组小鼠比较，无统计学意义(P＞0.05)；中药组小鼠血清中1FN－γ水平、肺组织中SOD和MDA与西药组小鼠比较亦无统计学意义(P＞0.05)。
2．2小鼠肺组织学改变 光镜下可见正常组小鼠肺组织形态无改变(如图1)；哮喘组小鼠气道周围有大量炎性细胞(淋巴细胞、嗜酸细胞等)浸润，肺泡间隔及支气管壁明显增厚(如图2)；中药组与哮喘组比较，气道周围炎性细胞浸润程度明显减轻，气泡间隔病变明显改善(如图3)。西药组小鼠与哮喘组小鼠相比，气道周围仅有少量炎性细胞浸润，肺泡间隔增厚不明显(如图4)。
3 讨论
研究证实当机体罹患哮喘时，免疫应答的平衡被破坏，导致Th1类细胞因子IFN－γIL―12等分泌减少和功能减退，其IFN－γ产生较正常明显减少，对IL-4及IgE的生成调节作用减弱。Th2类细胞因子IL-4、IL-5等分泌亢进，促进IgE产生和肥大细胞(MC)、嗜碱粒细胞(Bas)、嗜酸粒细胞(Eos)的生长分化和募集。由于各种免疫细胞被激活，释放各种炎症介质时出现呼吸爆发，产生大量氧自由基。氧自由基引发的脂质过氧化作用所造成的线粒体、细胞、组织损伤又可启动自由基发生连锁反应，产生新的自由基。过量的氧自由基使得SOD等拮抗物质大量消耗，使细胞膜受损，引发强烈的脂质过氧化反应，其反应终产物MDA则可反馈激活脂质过氧化反应，从而形成恶性循环导致气道上皮损伤、气道血管通透性增加、p肾上腺受体数目降低和功能减退以及白三烯等炎症介质合成释放增加，致使气道炎症发生。基于上述机制，如何促进IFN－γ分泌、清除过多的氧自由基和氧化反应产物、提高SOD等保护性抗氧化酶类物质已成为治疗哮喘的思路之一。本实验结果显示，促进IFN－γ分泌、抑制Th2：分泌、纠正体内Th亚群的失衡状态，提高肺组织抗氧化能力、维持氧自由基生成与清除的动态平衡，可能是加味射干麻黄汤能够治疗支气管哮喘的作用机制之一。与现代医学经典平喘药物糖皮质激素(地塞米松)相比，加味射干麻黄汤在抑制支气管哮喘小鼠气道炎症、降低气道高反应性方面的作用效果与前者相近，提示该方剂不仅遵循传统中医药学理法方药的配伍规律，而且其作用机制也与现代医学观点相吻合，为其临床进一步开发提供了理论依据。