DNA分子标记在大豆抗灰斑病育种中应用进展

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[摘要]大豆灰斑病是一种世界性大豆病害，曾给我国的大豆生产造成过重大的损失，将dna分子标记技术运用到抗病育种研究中，对有效控制这一病害具有促进作用。本文从种质资源的遗传多样性分析与利用，大豆灰斑病抗性基因的鉴定研究及分子标记标记辅助选择三个方面论述了DNA分子标记技术在大豆抗灰斑病育种中的应用研究概况，为抗病育种工作提供参考信息。

[关键词]大豆灰斑病；DNA分子标记；抗病育种

大豆灰斑病(Cercospora sojiina Hara)是世界性病害，国内各大豆产区均有发生，以黑龙江省最为严重。灰斑病对产量、品质都有很大影响，发病较重年份减产10％～15％，严重时可达到30％，病斑率也可高达30％～50％。大豆灰斑病的流行受品种、气候、菌源3个因子限制，根据国内外研究表明，其中以品种的基因型对发病影响最大，Mian用Rcs3基因的4对近等基因系进行了产量试验结果表明，供试个体的近等基因系在发病情况下缺少Rcs3基因比含有Rcs3产量要下降31％，揭示了抗病性与基因型之间的关联。防治大豆灰斑病的最经济有效的途径就是抗病育种，美国和中国等国家在抗灰斑病育种方面做了大量工作。

近年来，分子生物学发展异常迅速，其中与作物遗传育种密切相关的分子标记更是令人瞩目。DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映，能对各发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作检测，既不受环境的影响，也不受基因表达与否的限制；标记数量丰富；遗传稳定；对生物体的影响表现中性；操作简便。由于上述优点奠定了它具有广泛应用性的基础。近10年来DNA分子标记技术达到成熟，使大豆遗传研究发生了质的飞跃，相继有数十种分子标记技术问世。分子标记的出现为大豆抗灰斑病育种工作的开展作出了重要贡献。

一、种质资源的遗传多样性分析与利用

邹继军等(1998)对25份大豆灰斑病抗病种质资源进行了10个生理小种的抗性鉴定并用RAPD技术分析了各材料间的遗传关系。其中，抗8个以上生理小种的材料有9份，抗5～7个小种的材料有7份，感7个以上小种的材料有9份，为亲本选配和抗病基因定位提供了参考依据。陈庆山(2001)收集了黑龙江省94份大豆灰斑病种质资源，在对灰斑病10个生理小种抗性鉴定的基础上，用RAPD和SSR技术研究了种质资源间的遗传关系。其中，抗8个生理小种以上的材料共有17份，感8个生理小种以上的材料共有15份，并且得到了许多与各生理小种专化抗性有关的分子标记。金振国(2008)利用SSR技术(选择已整合到大豆遗传图谱上的具有代表性的SSR引物)，对黑龙江省大豆灰斑病有代表性的48份种质资源进行分析，得出相似系数和特异性指数具有很高程度的负相关性，特异性指数越高的品种，相似系数越低，即通过对特异性指数的统计.就可在一定程度上得到品种间的相似性关系。为今后能更好的利用种质资源提供了有利的理论依据。

二、抗性基因的遗传研究

国外对与大豆抗灰斑病抗性遗传的研究始于本世纪50年代。Athow(1952)、Probst(1965)等指出，大豆对美国1号、2号生理小种的抗性是受两对独立的显性基因控制的，分别为RcsI和Rcs2E，Philips和Boerma(1982)发现了控制5号小种的另一对显性基因Rcs3。Rcs3同时也抗2号小种，但与Rcs2不在同一位点上。Pace(1993)发现了另一个有别于Rcs3的抗性基因，对美国5号生理小种表现出抗性。

杨庆凯、张小刚(1996，1998)认为Hrcsl和Hrcs2分别控制大豆对中国灰斑病菌1、7号生理小种的抗性，而且其中一个基因在自身表达的同时，为另一个提供中等水平的抗性。胡国华(1996)用10个生理小种和60个大豆品种鉴定出10个限定性毒性基因和10个限定性抗性基因。

姜翠兰等(2011)以15号生理小种的抗病品种垦丰16、感病品种绥农10及其杂交F2、F3代群体为试验材料，运用SSR标记技术及BSA法对垦丰16抗病基因进行了定位，并应用108份大豆新品系对标记进行了符合性检测。结果表明，垦丰16对15号小种的抗性受对显性基因控制，抗病基因位于大豆染色体组的连锁群上，将该基因定名Rcsl5。

三、抗大豆灰斑病分子标记标记辅助选择

RoufMian等(1999)以Blackhawk(S)×Davis(R)的群体及F2 Wright和Wright6-Res3的近等基因系接种3号小种，从Blaekhawk(S)×Davls(R)的F群体分别取15株感抗单株DNA混合，形成感抗池，用SSR标记对感抗池及Wright和Wfight6-Rcs3的近等基因系进行筛选，发现Satt244，Satt547与Rcs3紧密连锁，这将为大豆抗灰斑病标记辅助选择提供可能。M.A.Rouf Mian(1999)对抗美国大豆灰斑病5号生理小种的Rcs3基因进行了分子作图，结果筛选出的7个引物都在J连锁群上，并且它们的作图顺序与Cregan(1999)作图得到的顺序完全一致。引物Sat244与Rcs3基因紧密连锁，它们之间几乎没有基因的重组，其次Sat547，它与Rcs3基因的遗传距离是1.5cM。Yang(2001)用AFLP和SSR两种标记技术对抗所有灰斑病小种的美国品种“Peking”所含有的抗性基因进行了分子标记，结果得到两个标记与抗性基因紧密连锁AACCTAl78和Satt244。这些标记位点的发现为抗大豆灰斑病标记辅助育种选择提供了准备。

邹继军等(1998，1999)在对东农91212(感7号小种)×东农9674(抗所有小种)的杂种后代抗性分析基础上，筛选到3个与抗病基因连锁的RAPD标记OPA0410pQl2500、OPS03620&580。其中OPS03620&580的两个片段0PS03620和OPS03620&580具有共显性的分离特点，0PS03620与抗病基因的遗传距离为8.7cM。根据该标记选择基因型纯合和杂合的抗病植株，其符合率分别达到100和97.6此标记还被进一步转化成RFLP标记和SCAR标记(SCS3620&580)。用SCS3620&580对62份大豆灰斑病抗感种质资源的测试显示，其在绝大部分抗、感种质之间存在明显多态性，在灰斑病抗病育种中具有广泛的应用价值。董伟等(1999)用高抗品种东农9674和高感品种东农87-104的杂交群体对中国大豆灰斑病1号生理小种进行RAPD多态性分析，其中3个引物在抗、感池间出现稳定的多态性标记0PK03840、OPMl71700和OP010950，并在F2代个体中表现出抗性与多态性标记协同分离的趋势，这三个标记与抗性基因Rfl的连锁顺序为OPK03~-Rfl-OPMl71700-OP010950，连锁距离分别为10.4cM-Rfl-13.8cM-26.1cM。张文慧(2004)用抗所有生理小种的品系

东农40566和感1号生理小种的品种东农410的杂交群体，针对中国大豆灰斑病1号生理小种，利用BSA法对500个SSR标记进行筛选，其中3个标记Satt565、SOYGPATR和Satt396在抗、感池间表现出稳定的多态性，并且在F2代个体中表现出抗性与多态性协同分离的趋势。这3个标记与抗性基因的连锁顺序为Satt 565-SOYGPATR-Hrcsl-Satt396，其中SOYGPATR与抗性基因的遗传距离为6.5cM。根据三个标记所在的连锁群推测抗大豆灰斑病1号生理小种的基因可能位于C1连锁群上。武小霞(2004)利用BSA法对500个SSR标记进行筛选，其中3个标记Satt565、SOYGPATR和Satt396在抗、感池间表现出稳定的多态性，并且在F2代个体中表现出抗性与多态性协同分离的趋势。丁俊杰等(2010)通过田间试验对142份育成大豆新品种(系)的灰斑病抗性进行鉴定，并且对大豆灰斑病抗性资源进行评估。筛选得到两个与大豆灰斑病抗性相关的SCAR标记，可用于大豆抗灰斑病的分子辅助育种研究。姜翠兰等(2011)利用SSR法和BAS法得到出5个与抗病基因紧密连锁的SSR标记：Satt 529、Satt 431、Sat_151、Satt 547和Sat_224，其中，Satt 547和Sat_224的检测准确率达到85％以上，可用于分子标记辅助选择育种和抗源筛选。为明确大豆对灰斑病菌15号小种的抗性位点。

四、问题与展望

大豆灰斑病菌的生理小种变化活跃，不断增加产生新的变异，在大豆灰斑病的间歇流行期间，使得有的抗病品种的抗性在维持一段时间后，丧失抗性。另外，我国抗灰斑病品种遗传基础较为狭窄，这就为大豆抗灰斑病育种工作增加了难度。

在育种研究方面，一方面应通过引进国外抗性资源来拓宽我国品种的遗传基础。另一方面应针对生理小种的种类和特点选育出具有对多个小种的抗性的品种，同时也要结合疫区的实际情况，选育出针对性的品种。

分子生物学的发展，特别是分子标记技术的发展及遗传图谱的日趋饱和，DNA分子标记技术将会在大豆抗灰斑病育种研究中发挥出更加重要的作用，大豆灰斑病的抗病基因得以精细定位.这不但为标记辅助选择提供了可能，而且为抗病基因的分离和克隆奠定了基础。

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