舒心稳斑颗粒对动脉粥样硬化兔血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶―9表达的影响

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摘要：目的 观察舒心稳斑颗粒对兔血清中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）水平、兔动脉粥样硬化（AS）斑块中血管内皮生长因子（VEGF）表达及斑块形成的影响，探讨舒心稳斑颗粒抗AS作用机制。方法 将40只健康日本大耳白兔随机分为空白对照组、模型组、辛伐他汀组和舒心稳斑颗粒组。空白对照组给予普通基础饲料喂饲，其余组给予高脂高胆固醇饲料喂养12周造成兔AS模型，灌胃给予相应药物4周，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清中MMP-9含量，采用免疫组化法分析主动脉粥样斑块中VEGF表达，同时观察主动脉及粥样硬化斑块病理学改变。结果 与模型组比较，舒心稳斑颗粒能明显降低血清中的MMP-9含量，差异有统计学意义（P

关键词：舒心稳斑颗粒；动脉粥样硬化斑块；血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶-9；兔

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0055-04

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管疾病的主要病理基础之一。研究表明，炎症反应在AS及其并发症的发生和发展过程中起到重要作用[1]。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）参与AS炎症反应，炎症反应能加速AS形成的进程[2]。血管内皮生长因子（VEGF）促进新生血管形成，高脂血症状态下，内源性VEGF参与血栓形成及内膜增生，促进AS发生发展[3]。本实验通过饲喂高脂饲料制造兔AS模型，观察舒心稳斑颗粒对兔AS斑块中VEGF表达、血清中MMP-9含量及斑块形成的影响，探讨其抗AS的可能作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

健康3月龄日本大耳白兔40只，雌雄各半，体质量（2.0±0.2）kg，湖南中医药大学实验动物中心提供。合格证号：湖南省医学实验动物管理委员会医动字20-003号。实验动物环境设施合格证号：湘医动字20-001号。动物进入实验室后单笼喂养，实验前第3日皮下注射兔三联疫苗（齐鲁动物保健品厂，批号1009027），以预防兔瘟。兔用基础饲料由湖南中医大学动物实验中心按标准配方制备后提供。

1.2 药物

舒心稳斑颗粒由血竭、虎杖、瓜蒌壳、明矾等中药组成，采用超微颗粒（湖南春光九汇现代中药有限公司生产），湖南中医药大学附属第一医院药剂科提供，实验所用超微颗粒每克含原药材6 g，临用时用100 ℃开水溶解配制成0.4 g/mL的药液。辛伐他汀片20 mg/片，临床常用量为20 mg/d（上海信谊万象药业股份有限公司生产，批号090802），临用时用蒸馏水溶解配制成0.2 mg/mL的药液。丙基硫氧嘧啶，南通精华制药有限公司，批号110301。

1.3 试剂

胆固醇粉（分析纯，25 g/瓶，上海试一化学制剂有限公司，批号091025）；猪油（市场上购回自熬）；蛋黄粉（陕西天斗蛋业有限公司提供，批号100706142）；MMP-9酶联免疫分析（ELlSA）试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂，购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.4 主要仪器

LD-A5型离心机（北京医用离心机厂生产），722分光光度计（上海第三分析仪器厂），TP-1000电子天平（湘仪天平仪器厂生产），酶标分析仪（型号TELAN SUNRISE，奥地利），MIAS医学图像分析系统（北京航空航天大学科学仪器厂），JEOL-1230型电子显微镜（日本JEOL公司），低温冰箱。

2 实验方法

2.1 分组

40只日本大耳白兔适应性饲养1周，称重并编号，采用随机数字表法随机分为空白对照组、模型组、舒心稳斑颗粒组、辛伐他汀组，每组10只。

2.2 造模

高脂饲料配方：胆固醇1%，猪油5%，蛋黄粉10%，基础饲料84%。将猪油加热溶解后，与胆固醇、蛋黄粉混合，且每100 g高脂饲料中加入20 mg丙基硫氧嘧啶[约按10 mg/（kg・d）计算）]，一并加入基础饲料中拌匀，用饲料制粒机压制成颗粒。参照文献[4-5]，动物称重、编号后，除留作空白对照组的动物外，其余动物给予高脂饲料喂养12周（每只动物每日上午给予高脂饲料100 g），动物造模12周后，随机抽取高脂饲料喂养兔2只处死，取出自心脏至髂主动脉分支处的主动脉标本作冰冻切片，光镜下观察造模情况，以证实产生AS斑块。所有动物自由饮水，继续喂养4周。

2.3 给药

AS模型造模成功后，根据成人70 kg临床用药量按动物体表面积计算给药量。舒心稳斑颗粒组每日灌胃0.53 g/kg（相当于原药材3.17 g/kg）舒心稳斑颗粒，辛伐他汀组每日灌胃1.96 mg/kg辛伐他汀片，空白对照组与高脂模型组每日灌胃生理盐水10 mL/只，均于每日上午给食前灌胃，连续4周。

2.4 标本采集与制备

2.4.1 血液采集与处理 于实验第16周末对家兔禁食12 h（不禁水），次日抽取空腹兔耳中央动脉血6 mL，分置于常规非抗凝生化管中，3000 r/min离心10 min，取上层血清，分装于-20 ℃低温冰箱保存，备用。

2.4.2 标本制备 2%戊巴比妥2 mL/kg耳缘静脉注射麻醉，取升主动脉至主动脉弓约1.5 cm，DEPC处理水洗净，置10%福尔马林中固定，制备石蜡切片（4 μm），用于免疫组织化学染色检测。

2.5 指标检测

采用ELISA测定血清中MMP-9含量，采用SABC法测定主动脉内膜中VEGF表达含量，检测步骤、方法均由专业人员严格按照试剂盒说明书操作。

2.6 结果判定

VEGF免疫反应阳性物质为棕黄色颗粒，在显微镜图像采集分析系统下，每组选取6张切片，每张切片随机观察5个视野，精确选取视野内所有阳性颗粒，计算机自动算出面密度（阳性目标总面积/统计场总面积），用于定量表达免疫组化阳性反应程度。

2.7 病理观察

取主动脉弓约1.5 cm，用10%甲醛溶液固定。常规石蜡包埋后切片，HE染色。在光学显微镜下观察主动脉壁形态结构。

3 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据用―x±s表示，先进行方差齐性检验，再采用方差分析。若有差异则进行2组间比较，LSD检验；若方差不齐，采用Tamhane’T2检验。P

4 结果

4.1 一般情况

造模早期个别动物因拒食高脂饲料衰竭而死，部分动物因灌胃操作不慎造成死亡，抽样检测2只表明家兔高脂血症合并AS斑块模型形成。其余死亡的动物均有腹泻症状，观察均可见污秽，解剖检查胃肠明显胀气。故每组检测各项指标时动物数为7～8只不等。最终取得完整资料者进入分析，共31只。

4.2 舒心稳斑颗粒对兔血清中基质金属蛋白酶-9含量的影响

模型组血清中MMP-9含量最高，经过药物干预，舒心稳斑颗粒组和辛伐他汀组MMP-9含量较模型组明显下降，差异有统计学意义（P

4.3 舒心稳斑颗粒对兔主动脉中血管内皮生长因子面密度的影响

主动脉内皮细胞胞膜和胞浆内有棕黄色颗粒为阳性表达。模型组VEGF含量最高，经过药物干预，舒心稳斑颗粒组和辛伐他汀组VEGF水平较模型组明显下降，差异有统计学意义（P

4.4 兔主动脉及粥样硬化斑块病理观察结果

空白对照组主动脉壁厚度较均匀，内膜结构光滑完整，内皮下无泡沫细胞及脂质沉积；模型组主动脉壁增厚，且薄厚不均，形成明显的AS斑块，内皮细胞损伤、脱落，内膜增生，中膜平滑肌细胞呈不规则增生；舒心稳斑颗粒组和辛伐他汀组可见内膜部分增厚，内皮细胞肿胀、变性减轻，泡沫细胞及脂质沉积较模型组减少，而且舒心稳斑颗粒组中沉积的泡沫细胞更少。见图2。

5 讨论

VEGF是有高度特异性的血管内皮细胞生长刺激因子，能特异性地作用于血管内皮细胞，刺激其增殖，促进血管新生的发生，在AS斑块形成过程中发挥着重要作用。VEGF可引起AS斑块内膜微血管的新生，新生的血管也可引起血浆渗出，斑块内出血和血栓形成，加速AS斑块生长、斑块重构及斑块破裂，从而引起急性冠脉综合征（ACS）的发生[6]。研究发现，VEGF可以与人不稳定斑块中的单核细胞、平滑肌细胞和内皮细胞明显共表达，表达区域主要集中在单核细胞浸润明显的斑块纤维帽、肩部以及脂质坏死区边缘新生微血管周围[7]。

MMP-9是一种糖蛋白，可由中性粒细胞、单核细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞等多种细胞分泌。MMP-9与炎症反应关系密切，MMP-9加剧炎症反应，MMP-9表达的上调反映了AS斑块的活跃程度，表明MMP-9在冠脉表达增加对ACS的发生有重要意义，较高的血清MMP-9水平可能提示斑块易损或破裂[8-9]。MMP-9在易损斑块的肩部表达增高更为明显，MMP-9通过降解细胞外基质，降解易损斑块的纤维帽，使纤维帽变薄，斑块破裂，形成血栓，导致ACS[10]。

现代研究表明，痰瘀互结与冠心病的脂质代谢紊乱和血液流变学有关，痰瘀是冠状动脉脂质斑块形成的主要病理基础[11]。痰瘀互结、阻于心络致气血运行不畅而发生冠心病心绞痛，且痰瘀郁久化热，痰、瘀等久恋不去，壅塞络道，郁而蕴蒸，凝聚化毒而内生邪毒。结合西医AS斑块的炎症反应学说，我们认为，冠心病是热毒痰瘀壅阻心络所致，从而使本病缠绵难愈。舒心稳斑颗粒系本课题组治疗冠心病的经验方，由虎杖、血竭、明矾等组成，功能清热解毒、化痰活血。本实验运用高脂高胆固醇饲料造成日本大耳白兔AS模型，该实验在传统的高脂饲料配方中添加了0.2%丙基硫氧嘧啶，这是因为甲状腺素可促进胆固醇在肝内转变为胆汁酸，丙基硫氧嘧啶抑制甲状腺功能，减少对胆固醇的代谢，保证血清胆固醇含量升高，以加速AS斑块形成。实验结果显示，对模型动物采用舒心稳斑颗粒进行治疗后，兔血清中MMP-9含量降低；同时可降低AS斑块中VEGF的表达量；病理观察结果显示，舒心稳斑颗粒干预后，主动脉粥样斑块面积减少、斑块厚度变薄。结果表明，舒心稳斑颗粒通过抑制VEGF在AS斑块中的表达、降低血清中MMP-9含量、抑制斑块内炎症反应，从而减少AS斑块形成。

参考文献：

[1] Li JJ. Silent myocardial may be related to inflammatory response[J]. Med Hypotheses，2004，62（5）：252-256.

[2] 陈礼波，李晓辉，张海港，等.炎症反应对兔腹主动脉粥样硬化形成的影响及其超声检查的评价[J].重庆医学，2009，38（21）：2674-2676.

[3] 王效杰，齐金萍，关宝丽.高脂血症小鼠动脉粥样硬化形成与血管内皮生长因子的关系[J].中国临床康复，2004，8（9）：1766-1767.

[4] 王园园，龙民慧，周磊磊，等.兔动脉粥样硬化动物模型的建立和评价[J].实验动物科学，2008，25（3）：18-21.

[5] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，2006：512-524.

[6] Celletti FL， Hicfiker PR， Ghafowri P， et al. Effect of human recombinant vascular endothelial growth factor 165 on progression of atherosclerotic plaque[J]. J Am Cell Cardinal，2001，103（7）：2126-2130.

[7] 曹勇军，钱进军，刘春风.基质金属蛋白酶-2、-8和血管内皮生长因子在人颈动脉粥样硬化不稳定斑块的定位共表达[J].中华神经外科杂志， 2008，41（2）：102-105.

[8] 马承泰，蒋艳霞，顾华丽，等.急性冠状动脉综合征患者血清基质金属蛋白酶-9和超敏C-反应蛋白水平及其相关性分析[J].中国中西医结合急救杂志，2010，17（6）：367-369.

[9] 韩轶鹏，王大明，刘加春，等.血清炎性标志物水平与颈动脉斑块稳定性的相关研究[J].中华外科杂志，2012，50（1）：70-73.

[10] Shu J， Ren N， Du JB， et a1. Increased levels of interleukin-6 and matrix metalloproteinase-9 are of cardiac origin in acute coronary syndrome[J]. Scand Cardiovasc J，2007，41（3）：149-154.

[11] 黎鹏程，程丑夫.论痰瘀是冠状动脉脂质斑块的主要病理基础[J].中医药导报，2012，18（7）：5-6.

（收稿日期：2013-10-29，编辑：华强）