桂枝特征化学成分与解热效应相关性研究
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摘 要：目的：确定桂枝解热作用与化学组分桂皮醛、桂皮酸的相关性，探索桂枝活性作用的物质基础。方法：采用高效液相色谱法建立桂枝色谱分析条件并测定特征性成分含量；以大鼠解热试验观察桂枝提取物解热效应。结果：通过SPSS软件进行回归，确定了桂枝中具有解热活性的成分。结论：桂皮酸与解热作用具有相关性，是桂枝中有效成分之一。
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2012)01-0199-03
Research of the Correlation Between the Characteristic Ingredients of Ramulus Cinnamomi And the Relieving Fever Effect
LIU Xinhua, ZHANG Ning, MA Yueming, CHEN Yuerong
(Science and Technology Experiment Centre, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203,China)
Abstract:Objective: To determine the correlation between the relieving fever effect of ramulus cinnamomi and its chemical ingredients cinnamal and cinnamic acid, and to explore which ingredients have the active effect. Method: Use HPLC to develop a chromatography method that can analyze and determine the concentrations of the characteristic ingredients in ramulus cinnamomi. The relieving fever effect of the extracts of ramulus cinnamomi is observed by the relieving fever experiment on the rats. Results: By using SPSS to make a regression analysis,the ingredients of ramulus cinnamomi which have the relieving fever effect were determined. Conclusion: The cassic acid correlates with the relieving fever effect and it is one of the effective ingredients in ramulus cinnamomi.
Key words:ramulus cinnamomi；chemical ingredients；relieving fever effect
桂枝来源于樟科植物肉桂的干燥嫩枝，始载于《神农本草经》，属辛温解表药，具有发散解表，助阳化表，温经通脉，平冲降气之功效[1-3。本实验将常用中药桂枝作为研究对象,通过桂枝的特征色谱信息和解热作用的研究，建立两者数学模式，确定桂枝解热作用与化学组分桂皮醛、桂皮酸相关性，为含桂枝复方中药研究奠定基础。
1 实验部分
1．1 仪器与材料
Agilent 高效液相色谱仪1200系列；UV100检测器；姆龙（OMRON）MC-612型电子体温计（欧姆龙大连有限公司）。
桂枝（产地：广东，购于上海养和堂中药饮片有限公司）；肉桂酸（分析纯，批号F20000721，购于中国医药集团上海化学试剂公司）；桂皮醛（含量测定用，批号110786-200503，购于中国药品生物制品检定所）；即发干酵母(批号：084E，梅山－马利酵母有限公司制造，冰箱保存)；阿司匹林肠溶片（批号：060912,南京白敬宇制药有限责任公司制造）；桂枝水提粉加挥发油（批号：070115、070409，自制）；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，实验用水为三蒸水。
SD大鼠，雄性，体重150~200g，由提供上海中医药大学实验动物中心提供。
1.2 色谱条件
色谱柱：Thermo ODS-2 HYPERSIL C18 (250mm×4.6mm,5μm)；流动相：A：0.1%磷酸 B：乙腈（梯度洗脱程序见表1）；流速：1mL•min-1；检测波长：278nm；柱温：30℃
1.3 供试品溶液的制备
称取桂枝饮片，加5倍量水提取挥发油4h,收集挥发油另器冷藏，药液滤过并浓缩，75℃真空干燥1h,制成干粉。按上法共提取5批，分别标记为0704115，070403，070405，070409，070413。各批水提粉干燥箱储藏，挥发油封口冰箱冷藏，备用。
称取药材提取粉约40mg，于纯水溶液10mL，超声20min，精密移取0.5mL药液至1mL纯水中，离心10min，作为供试品溶液①。
称取药材提取粉约40mg，于纯水溶液10mL，超声20min，精密移取0.5mL药液至1mL纯水中，离心10min后按照比例加入挥发油，作为供试品溶液②。
1.4 对照品溶液的制备
取桂皮醛、桂皮酸对照品各适量，精密称定，甲醇分别定容于10 mL量瓶，制得浓度为桂皮醛30.24μg•mL-1、肉桂酸20.2μg•mL-1对照品溶液。
2 桂枝特征色谱的建立
取5批提取桂枝药材粉末，分别按1.2项下方法制备供试品溶液，各进样2次，记录各样品在30min内的HPLC图谱(见图1)。结果桂枝5批药材粉末显示基本相同的特征峰(相对保留时间)。
2.1 精密度试验
取070115批桂枝水提粉及挥发油按1.2项下方法，连续进样6次，每次20μL，桂皮醛、桂皮酸峰面积的RSD分别为0.48%、0.46%。
2.2 稳定性试验
取070115批桂枝水提粉及挥发油按1.2项下方法，分别在日内及隔日连续进样，每次20μL，其共有峰面积稳定性RSD分别为桂皮酸0.17%,桂皮醛3.9%。
2.3 重复性试验
取070115批桂枝水提粉及挥发油按1.2项下方法，制成5份供试品溶液，各连续进样2次，每次10μL，进行桂皮酸与桂皮醛的含量测定，结果见表2。各成分含量RSD均小于3%。
3 解热药效实验
健康SD雄性大鼠150~180g，实验前1周购回，观察3天，电子体温计测定肛温（测量探头插入大鼠内2cm，温度计下端用胶布固定，避免操作中探头插人深度的误差。测量时应保持大鼠稳定，避免由于其剧烈运动造成测量误差。每只大鼠测3次，取平均值，每次测量间隔30s），选取基础体温为(37.2±0.5)℃者按体重进行随机分组，背部皮下注射12%酵母混悬液（2.4g/kg体重）进行筛选，选取注射后5.5h肛温升高大于0.8℃者，随机分成五组,即正常组（1），模型对照组（2），桂枝水提组（070115）（3），桂枝水提组（070409）（4），阳性对照组（5），每组6只，苦味酸标记。待体温恢复正常后进行实验。
实验室温度控制在(20±1)℃，给药前禁食12h，自由饮水。测量各组的基础体温。除正常组外，各组均皮下注射酵母混悬液（2.4g/kg体重），正常组给予同剂量生理盐水。给药组分别于注射酵母2，4，6h灌胃给予(070115)桂枝水提药液，（070409）桂枝水提药液，阿司匹林，模型对照组及正常组灌胃生理盐水(给药剂量见表3)。酵母造模后，分别于3.5，5.5，7.5h测量肛温。
3.1 实验结果与数据处理
药效实验结果见表4，图2。药效实验数据用SPSS 10.0软件处理，方差分析比较各组之间的显著性差异，检验水准为P
结果表明：模型组的体温变化值与正常组比较差异有非常显著性意义（P
将桂枝水提组（070115）所获得的指纹图谱中的桂皮酸，桂皮醛含量分别与解热实验数据各时间点下肛温之和进行典型性相关分析，用SPSS 10.0的双变量相关分析（Bivaritate）方法处理所得Pearson相关系数，结果见表6。
上述相关性分析结果表明，桂皮酸对解热作用有显著性意义（P0.05）。
桂皮酸相关系数为负数，表明加入桂皮酸量越多，降温效果越明显。
4 讨 论
试验中解热模型是经查阅文献后[4-5]，采用12％鲜酵母作为造模的药物，但因为鲜酵母购买不便，且不利于保存，现采用干酵母代替，预实验证明其造模有显著效果。经多次实验证明雄性大鼠对干酵母造模及药物均较敏感，故在药效实验中选择以雄性大鼠为实验对象。由于体温计插入大鼠内深度也将影响药效实验结果，在实验中为了减小实验误差，对实验测量手法应注意尽可能保持一致。
从药效实验可知，加挥发油组的降温效果略优于未加挥发油组，表明挥发油含有对解热有作用的活性成分。挥发油中主要含有桂皮醛、肉桂酸、香豆素等成分，通过对造模大鼠灌胃不同批次加挥发油桂枝提取物后，经过数据处理，发现水提桂枝组与水提桂枝-挥发油组较模型组有显著差异(P
中药药效的产生是多种化学组分共同作用的结果，需建立中药效应组分及多种化学组分与其生物效应间的定量关系。本实验通过对桂枝指纹图谱中两大主要峰桂皮酸，桂皮醛与药效实验的结果进行相关性分析。结果表明，桂皮酸与桂枝的解热作用有相关性(P
参考文献
［1］ 冷治文.桂枝汤类方中桂芍用量变化探析[J].辽宁中医药大学学报，2010，12（2）：67.
[2] 崔健，张晗睿，王庆国.王庆国应用柴胡桂枝干姜汤的经验[J].辽宁中医杂志，2009，36（7）：1213
[3] 徐漫远，严冬.桂枝汤的临床应用与研究概况[J]. 辽宁中医药大学学报，2010，12（5）：147.
［4］ 霍海如，谭余庆，秦彩玲，等.桂枝汤对酵母致自发性高血压大鼠高体温复合病理模型的影响[J].中国实验方剂学杂志，2004，10（2）：37-39.
[5] 李沧海，霍海如，周军，等．桂枝汤对发热及低体温大鼠下丘脑l5－羟基前列腺素脱氢酶活性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2003，9(1)：27-30.