HPLC法测定黄芪中槲皮素和山奈酚的含量

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【摘要】目的：建立黄芪中槲皮素和山奈酚含量的测定方法。方法：采用反相高效液相色谱法（hplc）测定不同来源黄芪中槲皮素和山奈酚含量。结果：不同来源样品中2种黄酮苷元的定量分析结果分别为槲皮素平均回收率97.88％，RSD=1.07％；山奈酚平均回收率为99.83％，RSD=1.10％。结论：黄芪中含有槲皮素和山奈酚，其含量随产地而变化。

【关键词】高效液相色谱法；黄芪；槲皮素；山奈酚

文章编号：1009-5519（2007）17-2550-02 中图分类号：R28 文献标识码：A

Determination of the contents of quercetin and kaempferol in astragalus membranaceus（fish.） bunge by HPLC

DIAN Ling-hui，WU Tie，LU Ying-nian

(Guangdong Medical College，Guangdong 523770，China)

【Abstract】Objective：To establish a HPLC method for the determination ofthe contents of quercetin and kaempferol in astragalus membranaceus（fish.）bunge.Methods：The determination of two kinds of flavonoid aglycones was performed by HPLC.Results：The average recovery of quercetin was 97.88%，RSD=1.07%．The average recovery of kaempferol was 99.83%，RSD=1.10%．Conclusion：There are quercetin and kaempferol in astragalus membranaceus（fish.）bunge，and their contents change with various origins．

【Key words】HPLC；Astragalus membranaceus（fish.）bunge；Quercetin；Kaempferol

黄芪为豆科植物黄芪[Astragalus membranaceus（Fish.）Bunge]和蒙古黄芪[Astragalus membranaceus（Fish.）Bunge var.mongholicus（Bge.）Hsiao]的干燥根，具有强心、抗自由基、促进蛋白质合成、护肝、增强机体的体液免疫和细胞免疫、抗衰老和抗辐射等作用[1]。槲皮素和山奈酚具有明显的降血压、降血脂、抗氧化剂等作用，现代药理研究发现槲皮素和山奈酚还具有抗肿瘤作用[2，3]。目前尚未见黄芪中槲皮素和山奈酚含量测定的报道，本实验采用反相高效液相色谱法（HPLC）同时测定黄芪中槲皮素和山奈酚的含量，该方法分离度高，重复性好，简便易行。

1 仪器与试药

岛津LC-10A型高效液相色谱仪(含在线脱气机)及紫外检测器。MET-TLER AE240全自动分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；三用恒温水浴锅(华北实验仪器有限公司)，SB-2200型超声波清洗机(上海必能信超声有限公司)；对照品：槲皮素（纯度98%），山奈酚(纯度98%天津药品生物制品检定所)，黄芪购于湛江市药材公司，甲醇（色谱纯），三次重蒸馏水，冰醋酸（分析纯），0.45μm微孔滤膜。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：采用Hypersil ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速0.8 ml/min，检测波长280 nm，柱温35 ℃，进样量5 μl，流动相为甲醇∶0.5%冰醋酸溶液（60∶40）。在此条件下，得到对照品及样品的色谱分离图(见图1)，黄芪样品中槲皮素和山奈酚色谱峰分别与其他成分分离良好。

2.2 对照品与供试品溶液的制备：精密称取槲皮素和山奈酚对照品适量，分别加甲醇制成0.183 mg/ml和0.124 mg/ml的对照品溶液。取不同来源黄芪各约1.00 g，分别加50 ml甲醇，精密称定，超声提取50分钟，补足甲醇，再精密称定，过滤，取续滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3 线性关系考察：分别精密吸取槲皮素对照品溶液1、2、3、4、5 μl和山奈酚对照品溶液1、2、3、4、5 μl按上述色谱条件，测定峰面积。以色谱峰峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，计算回归方程，槲皮素：Y=998409.44X -145559.9，γ=0.9998，线性范围0.183～0.915 μg；山奈酚：Y=756798.3871X-925.3，γ=0.9994，线性范围0.124～0.620 μg。

2.4 精密度试验：分别精密吸取同一份对照品溶液5 μl，连续进样5次，测得槲皮素色谱峰峰面积平均值为889230，RSD为0.78 ％。山奈酚峰面积平均值为459364，RSD为1.95 ％，说明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验：精密吸取同一样品溶液5 μl，分别在制备后0、2、4、6、8、12、24小时进样，测定槲皮素和山奈酚色谱峰峰面积，计算峰面积RSD分别为1.53％和1.72％，说明样品溶液24小时内稳定性良好。

2.6 重现性试验：取批号1同一样品，精密称取5份，按样品测定项下方法，分别测定槲皮素和山奈酚含量。结果槲皮素和山奈酚的平均含量分别为0.2576 mg/ml、0.0255 mg/ml，RSD分别为1.02％、1.53％。

2.7 回收率试验

2.7.1 槲皮素回收率试验：精确称取批号1的样品5份，每份精密称定1.00 g，加入槲皮素对照品0.549 mg。按2.2项下制备供试品溶液，按样品含量测定项下方法测定，计算平均回收率为97.88％，RSD为1.07％，结果见表1。

2.7.2 山奈酚回收率试验：精密称取批号1的样品5份，每份精密称定1.00 g，加入山奈酚对照品0.372 mg，按2.2项下制备供试品溶液，按样品含量测定项下方法测定，计算平均回收率为99.83％，RSD为1.10％，结果见表1。

2.8 样品含量测定：分别精密称取4批不同来源的黄芪药材粉末，按样品溶液的制备项下方法分别制备样品溶液；精密吸取5 μl注入液相色谱仪，依法测定，计算槲皮素和山奈酚的含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 提取方法的选择：比较了甲醇回流1.5小时和超声提取30分钟，发现这2种方法结果相差不大，由于超声提取方法操作简单、方便，故选用超声提取50分钟。

3.2 检测波长的确定：比较了360 nm和280 nm，结果发现槲皮素、山奈酚的甲醇溶液在280 nm处吸收好，并且与其它成分有较好的分离，其它成分对二者的含量测定干扰较少，故选择280 nm作为测定波长。

3.3 从图1可看出：在黄芪的甲醇提取物中含有与槲皮素、山奈酚2种黄酮苷元保留时间基本一致的色谱峰，提示所测样品含有上述2种黄酮苷元。本实验首次采用HPLC对黄芪的黄酮类成分进行分析，实验表明仪器的精密度、样品的稳定性、方法的重现性良好。从表2可以看出，不同来源的黄芪中槲皮素和山奈酚的含量有一定的差异，批号3槲皮素含量最高，而批号1山奈酚含量最高，批号4二者含量最低。从实验结果分析，山奈酚在黄芪中以游离苷元存在较少，可能以苷的形式存在，这有待进一步研究，该实验为黄芪黄酮类化合物及其制剂药理作用的进一步研究提供实验依据。

参考文献：

[1] 索 贞，任 敏，周好田. 黄芪的化学成分及现代药理[J]. 现代医院，2005，5（9）:85.

[2] 王艳芳，王新华，朱宇同. 槲皮素药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发，2003，15（2）:171.

[3] 孙 莲，严 雷，石晓呢，等. RP-HPLC测定桑叶、桑枝和桑花中槲皮素和山奈酚的含量[J]. 药物分析杂志，2005，25（10）:1230.

收稿日期：2007-05-24