白藜芦醇对脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞微小RNA—146a表达的影响

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【摘要】目的 观察白藜芦醇对脂多糖（LPS）诱导肺泡巨噬细胞微小rna-146a（miR-146a）表达的影响。方法 将体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞（NR8383）按2×106个/孔接种于六孔板，细胞贴壁90 min后，分为磷酸盐缓冲液（PBS）对照组、终质量浓度LPS（1 μg/mL）处理组、白藜芦醇（1 μg/mL）预处理30 min+终质量浓度LPS（1 μg/mL）处理组、白藜芦醇（1 0 μg/mL）预处理30 min+终质量浓度LPS（1 μg/mL）处理组。细胞培养6 h后，收集细胞和细胞培养上清液，采用实时荧光定量PCR检测细胞中miR-146a的表达变化，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养上清液中TNF-α蛋白的表达变化。结果 与PBS对照组相比，LPS处理组细胞中miR-146a和TNF-α蛋白表达量均明显升高[miR-146a表达倍数（5，92±1，57） 倍vs. （1，03±0，58） 倍，P

【关键词】 白藜芦醇；微小RNA-146a；肺泡巨噬细胞；肿瘤坏死因子-α

Effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide-induced micRoRNA-146a in alveolaR macRophages Zeng Zhenguo，Shao Qiang，Li Yong，Ding Chengzhi， Qing Cheng， Liu Fen， Zhan Yian， Nie Cheng， Jie Kemin， Gong Honghan， Qian Kejian. DepaRtment of CRitical CaRe Medicine， FiRst Affiliated Hospital， Medical College of Nanchang UniveRsity， Nanchang 330006， China

CoRResponding authoR： Qian Kejian，Email：qkj0607@sohu，com

【AbstRact】Objective To obseRve the effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide （LPS） -induced micRoRNA-146a （miR-146a） in alveolaR macRophages. Methods Rat alveolaR macRophages（NR8383）weRe seeded at 2×106cell/poRe in 6 well plates in vitRo and incubated foR 90 min. NR8383 weRe Randomly divided into fouR gRoups： contRol gRoup， NR8383 stimulated with phosphate buffeR solution （PBS）； LPS-stimulated gRoup， NR8383 stimulated with 1μg/mL of LPS； ResveRatRol-tReated gRoup， NR8383 tReated with diffeRent concentRations of ResveRatRol （1 μg/mL oR 10 μg/mL） foR 30 min， then stimulated with 1 μg/mL of LPS. AfteR incubation foR 6 h， the cells weRe haRvested and the supeRnatant of cell cultuRe medium was collected. The expRession of miR-146a of cells was detected by using fluoRoilluminance Real-time quantitative PCR device， and the levels of TNF-α pRotein in the supeRnatant weRe assayed by using enzyme-linked immunosoRbent assay （ELISA）.Results CompaRed with contRol gRoup， the expRession of miR-146a and the level of TNF-α weRe significantly incReased in LPS stimulated gRoup （miR-146a’ s expRession folds： 5，92±1，57 vs 1，03±0，58，P

【Key woRds】ResveRatRol； MicRoRNA-146a； AlveolaR macRophages； TumoR necRosis factoR-α

大量临床及实验研究表明，白藜芦醇对脓毒症肺损伤具有保护作用[1-5]。微小RNA-146a（miR-146a）是TLRs/NF-κB炎症通路中重要的负反馈调控介质，能够抑制炎症反应[6]。本课题组前期研究发现，miR-146a参与了肺泡巨噬细胞炎症反应，有望成为抑制肺泡巨噬细胞炎症反应的新途径[7-8]。研究发现，白藜芦醇与miRNA关系密切，有可能通过miRNA发挥其抗炎作用[9-11]。然而，在肺泡巨噬细胞炎症反应模型中，白藜芦醇是否影响miR-146a的表达以及是否通过上调miR-146a的表达来抑制炎症介质释放均未见报道。

1 材料与方法

1，1 实验材料

大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383（中国科学院细胞库），胎牛血清（美国HyClone），Ham’ s F-12K培养基（美国Sigma-AldRich），LPS（E，coli 0111∶ B4，美国Sigma-AldRich），白藜芦醇（美国Enzo life sciences），TRIzol Reagent（美国InvitRogen），四甲基偶氮唑盐（MTT，北京索来宝科技有限公司），TaqMan UniveRsal 聚合酶链反应（PCR）检测试剂盒、TaqMan MicRoRNA 逆转录试剂盒、TaqMan MicRoRNA 检测试剂盒（美国ABI），十二烷基硫酸钠（SDS，美国Sigma-AldRich），大鼠TNF-α ELISA试剂盒（上海明睿生物），氯仿、异丙醇、无水乙醇等均为国产分析纯。

1，2 细胞培养

R8383细胞培养于含15%FBS、1，5 g/L碳酸氢钠、2 mmol L-谷氨酰胺的Ham’ s F-12K完全培养基中，置于大气压下37 ℃、含5%体积分数CO2的温湿培养箱中培养，2～3 d更换培养液，3～4 d传代1次。

1，3 MTT比色法检测白藜芦醇对细胞活性的影响

取指数生长期NR8383细胞，按每孔细胞0，5×104个接种至96孔板。细胞贴壁90 min后，分别加入0，1、1、10、50、100 μg/mL终质量浓度的白藜芦醇，每组设5个复孔，同时设阴性对照组（等体积PBS替代白藜芦醇）和阳性对照组（等体积10%二甲亚砜替代白藜芦醇）。加药后细胞再培养48 h，加入5 g/L MTT 溶液20 μL/孔，继续培养4 h，加入三联溶解液100 μL/孔，于培养箱内继续孵育8 h，用酶标仪（波长570 nm）测定各孔的吸光度（OD 570 nm）值。

1，4 细胞处理及分组

取指数生长期NR8383细胞，按每孔细胞2×106个接种至6孔板。细胞培养90 min后，分为以下四组：（1） LPS处理组：培养板中加入LPS溶液（终质量浓度1 μg/mL）；（2） PBS对照组：培养板中加入等体积PBS溶液；（3） 白藜芦醇+LPS组：培养板中加入不同浓度白藜芦醇溶液（终质量浓度1 μg/mL、10 μg/mL）预处理30 min后，加入LPS溶液（终质量浓度1 μg/mL）。细胞培养6 h后，离心收集细胞上清液和细胞团块，保存于-80 ℃冰箱，分别用于ELISA检测和细胞总RNA提取。

1，5 检测指标及方法

1，5，1 TNF-α蛋白测定 收集各组细胞培养上清液，检测按照ELISA试剂盒使用说明书进行检测。

1，5，2 miR-146a表达测定 采用TRIzol法提取细胞中的总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性及纯度，紫外分光光度计测定总RNA浓度。采用TaqMan MicRoRNA逆转录试剂盒进行反转录，反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用TaqMan UniveRsal 聚合酶链反应（PCR）检测试剂盒进行PCR扩增，反应条件：95 ℃ 10 Rain；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个扩增循环，在ABI 7500定量PCR仪上扩增和检测。操作均按说明书进行，所有操作均在冰上完成。选取U6 snRNA作为内参照，miR-146a的相对表达量采用2-Ct计算。

1，6 统计学方法

采用SPSS 13，0统计软件进行分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P

2 结果

2，1 MTT比色法检测白藜芦醇对NR8383

细胞活性的影响

白藜芦醇在0，1～100 μg/mL的质量浓度范围内对NR8383细胞无毒性作用。见图1。

2，2 TNF-α蛋白含量及细胞内miR-146a的表达变化

表1显示，与PBS对照组相比，LPS处理组TNF-α蛋白含量及miR-146a表达均明显升高（P

3 讨论

脓毒症并发急性肺损伤是脓毒症高病死率的主要原因[12，13]，如果发生脓毒症时避免或减轻肺损伤的发生，将有助于提高脓毒症患者的成功救治率。肺组织中最多的非实质性细胞是肺泡巨噬细胞[14]，脓毒症发生时，肺泡巨噬细胞内TLRs/NF-κB炎症通路活化，导致大量炎症基因的转录活化，失控性释放大量炎症因子，形成肺内炎症“瀑布”反应，导致ALI的发生。LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要致病成分，是导致TLRs/NF-κB活化的常见因子。本研究结果显示，LPS刺激肺泡巨噬细胞后，导致TNF-α分泌显著增加。

白藜芦醇是一种多酚类化合物，是天然的植物抗菌素。它能够抑制肺泡巨噬细胞的活化，减少细胞内炎症因子的释放，避免或减轻脓毒症时肺损伤，提高脓毒症时肺损伤的治疗效果[1-5，15]。本实验研究也证实，白藜芦醇预处理大鼠肺泡巨噬细胞后，能明显抑制LPS诱导的炎症因子TNF-α 的产生，并且其抑制作用呈剂量依赖性。

miRNAs是一类小的内源性非编码RNA，通过识别靶基因mRNA的3’ 端非编码区来抑制靶蛋白的翻译或促进靶基因的降解[16-17]。miRNAs通过抑制炎症相关靶基因的转录表达，在炎症反应调控中具有重要作用。miR-146a在TLRs/NF-κB通路中具有重要调控作用。它的靶基因是TLRs/NF-κB通路中的两个重要接头蛋白编码基因IRAK-1和TRAF-6。miR-146a上调后将负性调控TLRs/NF-κB通路，能够抑制炎症介质的升高[6，18]。并且已证实miR-146a参与调节了LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应[7-8]。在本实验中，用LPS刺激肺泡巨噬细胞后，也诱导了miR-146a的表达上调，与前者报道结果相似。

研究发现，白藜芦醇通过影响miRNA前体的转录和miRNA的加工成熟，能特异性地引起一些miRNAs改变，包括miR-21、miR-146a、miR-663等，这些miRNAs都参与炎症反应的调控[9-11]。本研究发现，白藜芦醇预处理大鼠肺泡巨噬细胞后，能明显促进miR-146a的表达上调，并且相比于较低质量浓度白藜芦醇组（1 μg/mL组），较高质量浓度白藜芦醇组（10 μg/mL）更能诱导miR-146a的表达。

综上所述，在LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中，白藜芦醇能够抑制炎症因子TNF-α的产生，并上调miR-146a的表达，由此笔者可以推测，白藜芦醇调控炎症的机制之一可能是通过升高细胞内miR-146a的表达水平来发挥其抗炎作用。

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（收稿日期：2013-05-07）

DOI：10，3760/cma，j，issn，1671-0282，2014，01，009

基金项目：国家自然科学基金（81060152）；江西省自然科学基金（2009GZY0215）

作者单位：330006 南昌，南昌大学第一附属医院重症医学科（曾振国、邵强、丁成志、卿城、刘芬、詹以安、聂成、钱克俭），肿瘤科（李勇），影像科（龚洪翰）；南昌大学医学院生物化学与分子生物学教研室（揭克敏）

通信作者：钱克俭，Email：qkj0607@sohu，com

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