雌二醇强化壬基酚雄性毒性机理研究

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摘 要：为了揭示壬基酚进入生物体内后对雄性的毒性作用机制，以典型天然激素雌二醇（E2）为代表，以大鼠支持细胞为对象，研究了壬基酚与E2共存时对雄性生殖细胞的毒性并考察了其作用机理.研究结果表明，壬基酚与E2均能促进支持细胞增殖，表现出较强的雄性毒性，混合后呈现明显的强化效应，比二者单独作用高.对细胞征蛋白波形蛋白的检测发现，E2不影响波形蛋白的表达，壬基酚可提高其表达，而混合物可明显提高其表达.机理分析表明，在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的3条通路中，ERK通路是E2强化壬基酚毒性的关键通路.壬基酚降低ERK蛋白的表达，E2轻微降低ERK蛋白的表达，混合后反而诱导ERK蛋白的表达.壬基酚能够显著诱导pJNK蛋白、p38蛋白的表达，但与E2混合后，诱导作用减弱.转录因子分析表明，由于ERK通路被激活，壬基酚和E2混合物可极大地强化转录因子cMyc蛋白和cyclinD1蛋白的表达.

关键词：雌二醇（E2）；壬基酚；支持细胞；波形蛋白；ERK通路；毒性

中图分类号：X703.1 文献标识码：AMechanisms of Enhancing Male Toxicity

of Nonylphenol by 17Estradiol

环境激素是一类特殊污染物质，它们进入生物体后，激活或抑制内分泌系统的功能，能引起生殖系统损伤和神经损伤、诱发多种癌症、破坏免疫系统[1].近年来，大量文献报道人类的生育能力尤其是男性生育能力下降明显，男性不育和生殖系统发育异常明显增加[2].研究表明，这些现象的发生均可能与各种环境激素的存在有关[1].我国环境污染较为严重，多地均检出多种环境激素[3]，而男性不育症在我国也持续增长.其中壬基酚（Nonylphenol，NP）是广泛检出的一种环境激素[4]，其内分泌干扰毒性已被大量的野外观察和实验研究证实，能够对雄性动物产生一系列生殖毒性[5-6]，但具体机制仍然不是很清楚.

湖南大学学报（自然科学版）2012年第11期张盼月等：雌二醇强化壬基酚雄性毒性机理研究生物体内含有天然激素，环境中的壬基酚进入生物体后，与天然激素共同发挥作用，可能存在拮抗、协同和叠加等效应.因此，将壬基酚与天然激素混合，研究其复合效应，对了解壬基酚的雄性毒性具有重要意义，而相关的报导基本是空白.本文选择雌二醇（E2）作为天然激素的代表，E2是典型的雌激素，是人类雌激素中生物活性最强的一种；选择大鼠作为生物体的代表，大鼠是毒理研究中常用的生物.将壬基酚与E2混合，考察其雄性毒性，并对其作用机制进行探讨.

1 材料与方法

壬基酚、E2、胰蛋白酶、苯甲基磺酰氟、抑肽酶 A、亮抑肽酶、色胺酸等购自美国Sigma公司.丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺购自美国Ameresco公司.DMEM培养基、胎牛血清购于杭州四季青生物公司.E2单独投加时浓度为1.0×10-12 mol/L，壬基酚单独投加时浓度为1.0×10-8 mol/L，混合投加时各取50%.

实验所用大鼠为2～7 d的雄性乳鼠（SCXK（黑） 20020001），取其支持细胞进行研究[7].支持细胞是雄性生殖系统的重要组成部分，直接控制的产生，也是雄性生殖毒性的经典研究对象[8].

主要设备包括：GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems公司），DYY6B电泳仪（北京市六一仪器厂），蛋白质电泳及Western杂交转膜系统（BioRad），LSM Meta510 激光共聚焦仪（Zeiss公司）、IGO 150二氧化碳培养箱（Thermo公司）.

支持细胞的增殖效应（PE）为实验组与对照组吸光度平均值的比值采用Western Blot法测定丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路相关蛋白，以βTublin蛋白作为内参照，对目的蛋白表达量进行校正[7，9].采用RTPCR法测定EDCs干扰效应相关的转录因子Cfos基因、Cjun基因[7，10].

每次试验设定3次平行试验，每次平行试验设定6个平行样，实验数据最终经SPSS13.0方差分析进行处理.除非特殊说明，p

2 结果与讨论

21 对支持细胞增殖的影响

壬基酚、E2、混合物对于支持细胞增殖的影响如图1所示.壬基酚和E2均能使支持细胞增殖，表明二者均具有一定的雄性毒性.壬基酚和E2混合后细胞增殖效应更加明显，出现了加和效应.表明壬基酚进入生物体后，在天然雌激素的协同作用下，其雄性毒性加强，对生物体健康与遗传安全性不利.