微透析技术基于丹皮酚前非离子体软膏的皮肤药代动力学研究

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[摘要] 以大鼠为动物模型， 分别给予丹皮酚前非离子体软膏及其普通软膏1 g，以生理盐水为灌流液，灌流速度为5 mL・L-1，每隔20 min收集1次，共收集12 h，采用HPLC法测定丹皮酚的含量，研究丹皮酚前非离子体软膏及其普通软膏在大鼠皮下组织液及血液中药物浓度随时间的变化过程， 并对其药代动力学参数进行比较分析。结果表明探针体外回收率Rin vitro为（54.80±1.50）%，体内回收率Rin vitro为（54.58±4.61）%；皮肤药代动力学结果表明丹皮酚前非离子体软膏与普通软膏相比，显著提高了药物在皮肤组织液中的浓度，起到了缓释、长效作用。血液药代动力学结果表明丹皮酚前非离子体软膏与普通软膏相比，丹皮酚较少的进入血液中，药物浓度平稳。故该研究所构建的丹皮酚前非离子体软膏有望为皮肤湿疹的治疗提供一种新的制剂。

[关键词] 丹皮酚； 前非离子体； 微透析； 经皮给药； 药代动力学

[收稿日期] 2013-12-13

[基金项目] 广东省高校中药化妆品工程中心建设项目（GCZX-A1007）；广州市白云区科技计划项目（2010-KZ-28）；广州白云区科技计划重点项目（2011-KQ-17）

[通信作者] 刘强，博士，教授，研究方向为中药新制剂与新剂型，Tel：（020）61689408， E-mail：

[作者简介] 江晓，硕士研究生，Tel：15017552210， E-mail：

丹皮酚（paeonol，Pae）是毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.根皮和萝科植物徐长卿Pycnostelma paniculatum（Bunge）K.Schu全草的主要活性成分，具有镇静、催眠、解热、镇痛、抗炎、抗过敏和抗菌等多种药理活性[1]。近几年研究发现丹皮酚能抑制黑色素细胞内酪氨酸酶活性及黑色素生成，对色斑、皮肤瘙痒、牛皮癣等具有较好的治疗作用[2]。但由于其水溶性差、熔点低、易挥发和稳定性差等缺点，限制了它的使用和疗效。因此有必要利用现代药物新剂型与新技术，对丹皮酚制剂进行剂型改进。

前非离子体[3]（proniosomes）也叫前体非离子表面活性剂囊泡，是一种继脂质体、非离子表面活性剂囊泡（niosome）后的一种新型的药物储库型剂型，它是以非离子表面活性剂为辅料制成的囊体，使用前加水水合即可产生非离子表面活性剂囊泡的水合分散体，有效解决非离子表面活性剂囊泡溶液状态时囊泡易聚集、融合、药物易泄露等问题，是一种具有研究价值的新型制剂技术。

本实验以丹皮酚为模型药物，构建以丹皮酚前非离子体为载体的经皮给药系统；采用微透析采样技术与HPLC联合，实时监测丹皮酚前非离子体软膏及其普通软膏经大鼠腹部皮肤给药后皮下组织液及血液中药物浓度，从而全面评价丹皮酚前非离子体软膏在皮肤局部及全身的药物生物利用度情况，为该种制剂的研发和评价提供参考。

1 材料

高效液相色谱仪（Agilent 1100 系列：Agilent G1311A泵、Agilent G1316A紫外检测器、Agilent G1313A自动进样器），CMA/402双通道微透析泵（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），MAB 85冷冻收集器（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），微量注射器（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），CMA20 ME Elite 同心环形微透析探针（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），CP2250型电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）。

丹皮酚对照品（购自中国食品药品检定研究院，批号110708-200506）；丹皮酚（西安金绿生物工程技术有限公司，质量分数为98%）；硫化钠（杭州恒鑫达化工有限公司），水合氯醛（天津市大茂化学试剂厂），色谱级甲醇（美国默克公司）。

雄性Wistar大鼠，体重200～230 g，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK（粤）2011-5015。

2 方法

2.1 色谱条件

2.1.1 色谱条件 Syncronis C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相甲醇-水（60∶40）；流速1.0 mL・min-1；柱温25 ℃；检测波长276 nm；进样体积10 μL。

2.1.2 标准曲线的制备 精密称取丹皮酚对照品3.19 mg置1 000 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得3.19 mg・L-1的丹皮酚储备液。精密吸取该储备液1，2，4，6，8，10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加生理盐水稀释至刻度，配成系列对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件进样，以质量浓度（g・L-1）为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程Y=36 501X+7.39（r=0.999 6），线性范围319～3 190 μg・L-1。日内、日间精密度均小于5%， 符合方法学要求。

2.2 丹皮酚前非离子体软膏及其普通软膏的制备

2.2.1 丹皮酚前非离子体软膏的制备 分别取丹皮酚50 mg、胆固醇75.4 mg、大豆卵磷脂1.079 g、山梨坦单硬酯酸酯（司盘60）744.9 mg于具塞试管中，精密加1.25 mL无水乙醇，加盖密封，（65±3） ℃水浴加热直至所有成分完全溶解，再精密加入800 μL的pH 7.4的PBS溶液，（65±3）℃下再水浴加热至形成澄清溶液，取出，室温冷却，即得丹皮酚前非离子体。

取硬脂酸11 g、单硬脂酸甘油酯2.5 g，加热溶解（70 ℃）；再将碳酸钾0.9 g、三乙醇胺0.3 mL、甘油10 g、水72 mL加热至70 ℃，缓缓倒入油相中，边加边搅拌，至乳化完全，得软膏基质。将丹皮酚前非离子体与软膏基质按1∶1混合搅拌均匀，即得丹皮酚前非离子体软膏。其中，丹皮酚的含量为0.34%。

2.2.2 丹皮酚软膏的制备 软膏基质制备同2.2.1，至乳化完全后，加入丹皮酚0.3 g，混匀，即得。其中丹皮酚含量为0.3%。

2.3 微透析探针体外回收率的测定

根据预实验研究结果， 固定灌流液的灌流速度为5 μL・min-1， 分别采用增量法（Gain 法）和减量法（Loss 法）考察了丹皮酚不同浓度对同心圆环形探针体外回收率的影响。

2.3.1 增量法测定探针回收率 将同心圆环形探针（探针膜长10 mm，截留相对分子质量为2 000 Da）分别浸入3种不同质量浓度的丹皮酚生理盐水溶液（Cin 36，180，900 μg・L-1）的反应瓶中，磁力搅拌转速为200 r・min-1，水浴温度（37±0.5） ℃。以空白生理盐水为灌流液，灌流速度5 μL・min-1，平衡1 h后开始收集，每隔20 min收集1次，每个浓度收集5份，每次100 μL。用HPLC测定透析液中药物含量Cout。计算丹皮酚的回收率RG。

2.3.2 减量法测定探针回收率 将同心圆环形探针（探针膜长10 mm，截留相对分子质量为2 000 Da）分别浸在空白生理盐水溶液的反应瓶中，磁力搅拌转速为200 r・min-1，水浴温度（37±0.5）℃。分别以不同质量浓度的丹皮酚生理盐水（Cin：36，180，900 μg・L-1）为灌流液，灌流速度5 μL・min-1，平衡1 h后开始收集，每隔20 min收集1次，每个浓度收集5份，每次100 μL。用HPLC测定透析液中药物含量Cout。采用公式100%计算丹皮酚的回收率RL。

2.4 微透析探针体内回收率的测定

2.4.1 脱毛剂的配制 取硫化钠8 g，加60 ℃温水60 mL，使其全部溶解后，加入75%的乙醇40 mL，即制成了8%的硫化钠乙醇溶液。

2.4.2 手术方法 取Wistar大鼠，称重，采用10%的水合氯醛腹腔注射使其麻醉（3.5 μL・g-1），首次注射后，每隔1.5 h注射首次剂量的一半以维持大鼠的麻醉状态。用8%的硫化钠乙醇溶液对其腹部进行脱毛，将其仰卧固定于鼠板上，将撕裂管套住穿刺针，植入皮下，抽出穿刺针，撕裂管留在皮下。将同心环形探针从撕裂管开口处引导入皮下，撕开撕裂管，探针即植入皮下，用医用胶带固定探针位置。于此同时，用眼科剪在大鼠的右颈部剪开一个长约1 cm的切口，钝性分离颈静脉，扎闭其近心端，用穿刺针将撕裂管引导入血管[4]，用上述同样的方法将探针引导入血管，再用缝合线将探针与静脉接扎固定，取一蘸有生理盐水的棉球遮蔽手术伤口部位。均以不同质量浓度的丹皮酚生理盐水（Cin 36，180，900 μg・L-1）为灌流液，保持灌流速度为5 μL・min-1，平衡1 h后开始收集，每隔20 min收集1次，每个浓度收集5份，每次100 μL。采用高效液相法测定Cout，计算丹皮酚的回收率。

2.5 丹皮酚前非离子体软膏及其普通软膏的药代动力学研究

取Wistar大鼠6只，随机分为2组，每组3只。按照2.3.2项下手术方法处理，分别于大鼠腹部涂抹丹皮酚前非离子体软膏及其普通软膏各1 g，采用玻璃给药器（给药面积3.14 cm2）密封固定于大鼠腹部。采用生理盐水作为灌流液，灌流速度为5 mL・L-1，每隔20 min收集1次，共收集12 h。采用高效液相法测定收集液中丹皮酚的含量。

2.6 数据处理与分析

药动学参数计算与统计分析借助PKSolver软件完成。采用SPSS 13.0对2个样本均数进行独立样本t检验（independent-sample t test），大鼠血液及皮下组织液中丹皮酚浓度-时间曲线采用GraphPad Prism 5.0作图软件处理。

3 结果

3.1 微透析探针体外回收率

采用增量法（Gain法）和减量法（Loss法）考察丹皮酚不同浓度对同心圆环形探针体外回收率的影响，见表1。结果表明丹皮酚的体外回收率与释放率相差不大，说明不同的浓度对探针的回收率影响很小，且2种方法测得的回收率在不同浓度下基本保持一致，回收率测定结果为（54.80±1.50）%，从而为确定采用反向透析法测定丹皮酚体内回收率提供了依据。

3.2 微透析探针体内回收率

探针体内回收率测定结果见表2。由表2可知，不同浓度的丹皮酚溶液体内回收率相差不大，说明恒定流速的情况下，丹皮酚在体内的回收率不受浓度的影响。由表1，2可知，通过增量法求得的丹皮酚体内、体外的回收率基本一致，丹皮酚体内回收率Rin vivo（54.58±4.61）%。因此，可以采用体内回收率来校正在体微透析试验的数据。计算公式如下。

3.3 丹皮酚前非离子体软膏及其普通软膏的药代动力学研究

采用HPLC法测定的皮下组织液及血液中丹皮酚含量经校正后得到丹皮酚真实的药物浓度。丹皮酚前非离子体软膏和丹皮酚普通软膏的大鼠血液中丹皮酚含量-时间曲线见图1，皮下组织液药物含量-时间曲线见图2。采用PKSolver药动学软件统计，以非房室模型为拟合模型，通过统计矩分析出丹皮酚前非离子体软膏及丹皮酚普通软膏血液中药动学参数见表3，由表3可以看出，丹皮酚前非离子体软膏的t1/2，MRT，Tmax明显大于普通软膏，而AUC，Cmax相反，表明丹皮酚前非离子体软膏经大鼠腹部皮肤给药后丹皮酚较少的进入血液中，但其在体内的消除较慢，平均滞留时间也较长，药物浓度波动不大。说明丹皮酚前非离子体软膏经皮给药后可长时间、平稳的进入血液中，具有一定的缓释作用。而普通软膏中的药物更多的集中在血液中，但体内消除较快，平均滞留时间较短。皮下组织液药动学参数见表4。由表4可知，丹皮酚前非离子体软膏各项药动学参数均大于普通软膏。表明丹皮酚前非离子体软膏经皮给药后，丹皮酚更多的聚集在皮下组织液中，药物的达峰浓度高，平均滞留时间长，体内消除慢，可维持10 h，起到了一定的缓释、长效作用。而丹皮酚普通软膏经皮给药后，较短时间达到峰值，但体内消除快，持续时间短，仅能维持6 h。

4 讨论

4.1 数据处理中模型的选择

目前药动学参数研究多通过房室模型和非房室模型来构建，但经皮给药系统因其“绝对吸收量及绝对生物利用度低”，故其药动学具有特殊性。如果将血液视为中央室，局部组织视为周边室，则药物在血液和局部组织间处于某种平衡，此平衡既受其理化性质影响，亦受其制剂或机体因素影响，因此药物从血液向组织的转运量难以精确获得，故房室模型不适合局部药物动力学的研究，而多采用非房室模型[5]处理。本课题药动学参数主要是采用非房室模型的矩形拟合，模型拟合良好。

4.2 丹皮酚前非离子体软膏药动学参数的分析

由上述实验可知，丹皮酚前非离子体软膏药物含量无论是在血液中还是皮下组织液中，其达峰时间均慢于丹皮酚普通软膏。这可能是由于前非离子体的药物穿透机理是药物直接从囊泡迁移到皮肤或是囊泡进入角质细胞间脂质中[6]，从而使药物在前期进入皮肤比较缓慢。本实验采用血液-皮下组织液同步检测方法，发现丹皮酚普通软膏经皮给药后，丹皮酚较快进入皮下，再通过微循环进入到血液中，但是无论是皮下组织液中还是血液中丹皮酚的消除均较快，持续时间短，无法发挥长效作用。而丹皮酚前非离子体软膏经皮给药后，药物更多的蓄积在皮肤组织液中而不是广泛分布在全身血液中，且其在体内的消除较慢，平均滞留时间长，能持续10 h，发挥了一定的缓释、长效作用。这对于经皮给药系统来说具有很好的优势，因良好的经皮给药制剂应能使药物尽量少的进入血液循环，而较多的保留在皮肤中，在真皮内形成有效的活性成分贮库，持久地对皮肤疾病发挥治疗作用，避免全身性毒副作用。

本实验中丹皮酚前非离子体软膏能连续10 h缓慢释放药物，达到了缓释、长效的目的，能减少用药次数。同时与Hanan等[7]研究结果相一致，其研究中将长春西汀制成前非离子体贴剂，与口服片剂相比，贴剂在前12 h药物缓慢释放，浓度增加，发挥长效、缓释作用。

[参考文献]

[1] 李骅，王四旺，张邦乐. 丹皮酚的药理活性和药物动力学研究进展[J]. 亚太传统医药，2010（2）：110.

[2] 邢国胜，房德敏. 丹皮酚的制备及药理作用研究进展[J]. 中草药，2006，37（11）：2.

[3] Hu C， Rhodes D G. Proniosomes： a novel drug carrier preparation[J]. Int J Pharm，1999，185（1）：23.

[4] Mizojiri K， Okabe H， Sugeno K， et al. Studies on the metabolism and disposition of the new retinoid 4-[（5，6，7，8-tetrahydro-5，5，8，8-tetramethyl-2-naphthyl）carba-moyl] benzoic acid. 1st communication： absorption， distribution， metabolism and excretionafter topical application and subcutaneous administration in rats[J]. Arzneimittelforschung， 1997， 47（1）：59.

[5] 张英丰，于洋，周莉玲. 微透析技术-同位素示踪法联用进行青藤碱贴剂的皮肤局部药代动力学研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2010，16（6）：147.

[6] Hofland H E J， Bouwstra J A， Ponec M， et al. Interactions of nonionic surfactant vesicles with cultured keratinocytes and human corneum in vitro――a survey of toxicological aspects and ultrastructural-changes in stratum-corneum[J]. J Contr Rel， 1991，16：155.

[7] Hanan M El-Laithy， Omar Shoukry， Laila G Mahran. Novel sugar esters proniosomes for transdermal delivery of vinpocetine：preclinical and clinical studies[J]. Eur J Pharm Biopharm， 2011， 77：43.

Preparation of paeonol transdermal delivery systems based on

proniosomes-based ointment and its pharmacokinetics characters

JIANG Xiao， LIU Li， LI Sha-sha， ZHANG Bin， LI Xue-ling，LIU Zhi-gang， LIU Qiang

（1.Guangzhou Xiangxue Pharmaceutical Corporation Limited， Guangzhou 510530， China；

2.School of Traditional Chinese Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China）

[Abstract] The paeonol proniosomes ointment and ordinary ointment were administered to rats. Physiological saline served as perfused solution. The perfusion rate was 5 mL・L-1 and the microdialysis samples were collected every 20 min intervals. The paeonol concentration in perfused solution was determined by HPLC. Investigation of the pharmacokinetics of paeonol proniosomes ointment and ordinary ointment by the skin-blood synchronous microdialysis coupled with HPLC is reported in this study. The results show that the recovery was （54.80±1.50）% in vitro and （54.58±4.61）% in vivo.The results showed that paeonol proniosomes ointment significantly raised the drug concentrations in skin more than the paeonol ordinary ointment. The paeono proniosomes ointment has less drugs into the blood as the ordinary ointments in blood， but its blood drug concentrations were steadier. The paeonol proniosomes ointment may be developed into a new preparation.

[Key words] paeonol； proniosomes； microdialysis； transdermal delivery system； pharmacokinetics

doi：10.4268/cjcmm20141137