洁阴净洗剂的质量控制方法研究

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[摘要] 目的:建立洁阴净洗剂的质量控制方法。方法:采用薄层色谱法对洁阴净洗剂中苦参、百部、黄柏进行定性鉴别,应用高效液相色谱法对洁阴净洗剂中主药黄柏中所含的盐酸小檗碱进行含量测定。结果:薄层色谱法能准确鉴定出制剂中的苦参、百部、黄柏;盐酸小檗碱在3.84～38.40 μg/ml浓度范围内线性关系良好(r=0.999 9),平均回收率为100.32%,RSD为1.07%(n=9)。结论:本文所建立的方法可准确地对该制剂进行定性、定量检测,可作为洁阴净洗剂的质量控制标准。

[关键词] 洁阴净洗剂;苦参;百部;黄柏;盐酸小檗碱;质量控制

[中图分类号]R927 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)08(a)-067-03

Study on methods of quality control of Jieyinjing Lotion

LI Yanling1, LI Xiuying2

(1.Jiangmen Wuyi Hospital of TCM/the Sixth Affiliated Hospital of Ji'nan University Medical College, Jiangmen 529000, China; 2.Guilin Medical University, Guilin 541004, China)

[Abstract] Objective: To establish the quality control methods of Jieyinjing Lotion. Methods: Radix Sophorae Flavescentis, Radix Stemonae and Cortex Phellodendri Chinensis in Jieyinjing Lotion were identified by TLC. The content of berberine hydrohloride in Jieyinjing Lotion was determined by HPLC. Results: Radix Sophorae, RadixStemona and Cortex Phellodendri Chinensis could be identified by TLC. The berberine hydrohloride showed a good linear relationship in the range of 3.84-38.40 μg/ml, r=0.999 9,and the average recovery was 100.32% with a RSD of 1.07%(n=9). Conclusion: These methods are accurate and can be used in the quality control of Jieyinjing Lotion.

[Key words] Jieyinjing Lotion; Radix Sophorae Flavescentis; Radix Stemonae; Cortex Phellodendri Chinensis; Berberine hydrohloride; Quality control

洁阴净洗剂是由黄柏、苦参、百部、花椒等药材制成的一种复方制剂,具有清热燥湿、消炎止痒的功效,临床上主要用于治疗盆腔炎、阴道炎、宫颈炎等症。方中黄柏为主药,具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的作用[1],盐酸小檗碱是黄柏的主要化学成分[2],常用测定方法有高效液相色谱法(HPLC)[3-5]等。为有效控制制剂质量,本文采用薄层色谱法(TLC)对处方中苦参、百部、黄柏进行定性鉴别,并用HPLC对盐酸小檗碱进行了含量测定,为建立完整的质量控制标准提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪LC-10A,SPD-10AVP紫外检测器(日本岛津);ANASTAR色谱数据处理系统。

1.2 试药

盐酸小檗碱标准品(中国药品生物制品检定所,批号为0713-200107);洁阴净洗剂(250 ml/瓶,由本院制剂室提供,批号为071128、071116、071206、080615、080805);对照药材黄柏(批号为090302)、苦参(批号为090216)、百部(批号为090225)均由江门市海林饮片厂提供,经本院药检室鉴定,均符合《中国药典》2005版一部有关规定;硅胶G(青岛海洋化工厂);超纯水;乙腈、甲醇为色谱纯;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 苦参的鉴别取样品30 ml,加浓氨试液调pH 值至12,加氯仿20 ml,振摇提取,分取氯仿液,水浴蒸干,残渣加乙醇1 ml使之溶解,作为供试品溶液;另取苦参对照药材2 g,加水20 ml,煎煮2次,每次1 h,滤过,合并滤液,浓缩至20 ml,缺苦参的阴性对照样品同法制成苦参对照药材及阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各20 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,置于氨蒸气饱和的展开缸中,以苯-丙酮-醋酸乙酯-浓氨试液(5∶7.5∶10∶1)为展开剂,展开,展距15 cm,取出,晾干,喷以碘-碘化钾溶液。供试品色谱图中,在对照药材色谱图相应的位置上,显相同颜色的两个斑点,而阴性对照品无此斑点,见图1。

图 1 苦参鉴别薄层色谱图

(1.供试品;2.苦参对照药材;3.阴性对照)

Fig.1 TLC chromatogram of Radix Sophorae Flavescentis

(1.Sample; 2.Radix Sophorae Flavescentis reference drug; 3.Negative sample)

2.1.2 百部的鉴别取样品30 ml,加浓盐酸调至盐酸浓度为1%,加氯仿15 ml提取,分取氯仿层,水浴蒸干,残渣加甲醇1 ml使之溶解,作为供试品溶液。取百部对照药材煎煮液20 ml,及缺百部的阴性对照样品同法制成百部对照液及阴性对照液。吸取上述3种溶液各50 μl,分别点于同一以CMC-Na为黏合剂的硅胶G薄层板上,以氯仿-丙酮-甲醇(7∶1∶2)为展开剂,展距15 cm,取出,晾干,喷以碘-碘化钾溶液,在日光下检识,供试品色谱图中,在对照药材色谱图相应的位置上,显相同颜色的3个斑点,而阴性对照无此斑点,见图2。

图 2 百部鉴别薄层色谱图

(1.供试品;2.百部对照药材;3.阴性对照)

Fig.2 TLC chromatogram of Radix Stemonae

(1.Sample; 2.Radix Stemonae reference drug; 3.Negative sample)

2.1.3 黄柏的鉴定取样品30 ml,加浓氨试液调pH值至12,加氯仿萃取2次,每次15 ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣加1 ml甲醇使之溶解,加1滴浓盐酸作为供试液。另取黄柏对照药材煎煮液20 ml,加水饱和的正丁醇萃取2次,每次10 ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣加1 ml甲醇使之溶解,加1滴盐酸作为对照溶液。取缺黄柏、按处方比例制成的阴性对照样品同法制成阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各20 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂,展距15 cm,展开,取出,晾干,在紫外灯(365 nm)下检视,供试品色谱图和黄柏对照药材在相应的位置上显2个亮黄绿色的荧光斑点,阴性对照液无此斑点,见图3。

图 3 黄柏鉴别薄层色谱图

(1.供试品;2.黄柏对照药材;3.阴性对照)

Fig.1 TLC chromatogram of Cortex Phellodendri Chinensis

(1.Sample; 2.Cortex Phellodendri Chinensis reference drug; 3.Negative sample)

2.2 含量测定

2.2.1 HPLC色谱条件色谱柱为岛津Shim-pack VP-ODS柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈-0.5%冰醋酸(20∶80)溶液;流速为1.0 ml/min;检测波长为346 nm;柱温为25℃;进样量为20 μl(定量环)。

2.2.2 供试品溶液的制备精密吸取洁阴净洗剂2 ml,加甲醇溶解并定容于25 ml容量瓶中,摇匀,用0.45 μm微孔滤膜过滤,作为供试品溶液。

2.2.3 检测波长的确定用甲醇溶液配制盐酸小檗碱对照品溶液(约0.1 mg/ml),在6010-紫外分光光度计(惠普上分)上200～400 nm范围扫描,在346 nm波长处有最大吸收,故选之为检测波长。

2.2.4 对照品溶液的制备与线性关系考察精密称取盐酸小檗碱对照品4.8 mg,置25 ml容量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成对照品储备液,分别精密吸取上述盐酸小檗碱对照品储备液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 ml置10 ml容量瓶中,加甲醇溶液配制成浓度为3.84、9.60、19.20、28.80、38.40 μg/ml的对照品溶液,分别以20 μl进样,测得峰面积,得回归方程为A=25 482X+11 395,r=0.999 9,表明盐酸小檗碱在3.84～38.4 μg/ml浓度范围内线性关系良好。

2.2.5空白试验按处方比例和制法制成不含黄柏的样品,并按供试品溶液的制法制成空白对照溶液。依法进样测定,结果空白对照溶液在盐酸小檗碱保留时间处无色谱峰,表明在实验条件下,其他药材成分对测定无干扰,见图4。

图 4 洁阴净洗剂的高效液相色谱图

(A.盐酸小檗碱对照品; B.样品;C.阴性对照;1.盐酸小檗碱)

Fig.1 HPLC chromatogram of Jieyinjing Lotion

(A.Berberine hydrochloride reference; B.Sample; C.Negative sample; 1.Berberine hydrochloride)

2.2.6 稳定性试验取同一批号(批号为071128)的供试品溶液,按供试品溶液的制备方法,依上述色谱条件,于制备后0、1、2、3、4、8、10、24 h进行测定。结果样品溶液平均峰面积为415 003, RSD为1.11%(n=7),表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 精密度试验取同一份供试品溶液,每次进样20 μl,重复进样6次,结果平均峰面积为415 433,RSD为1.18%(n=6),表明本法精密度良好。

2.2.8 重复性试验取同一批号(批号为071128)样品溶液,按供试品溶液的制备方法,依上述色谱条件测定,结果平均含量为197.89 μg/ml,RSD为1.00%(n=5),说明本法重现性良好。

2.2.9 加回收率试验精密吸取已知含量(含量分别为197.77、195.95、202.00 μg/ml)的样品各3份,共9份,每份1 ml,分别加入浓度为192.00 μg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液0.5、1.0、1.5 ml,混匀,按样品溶液制备项下操作制备供试液,分别进样,测定峰面积,计算结果见表1。

表 1 盐酸小檗碱加样回收率试验结果(n=9)

Tab.1 Determination results of recoveries(n=9)

2.2.10 样品测定取5批样品,分别精密量取2 ml,依法制成供试品溶液,分别以20 μl进样,测定吸收峰面积,以外标法计算盐酸小檗碱含量,结果见表2。

表 2 洁阴净洗剂中盐酸小檗碱含量测定结果(n=5)

Tab.2 Content determination results of berberine hydrohloride

in Jieyinjing Lotion(n=5)

3 讨论

在对制剂中的苦参进行TLC鉴别时,参照有关文献[6-7],其多次展开结果都曾出现斑点拖尾的现象,故在展开剂中适当增加碱性试剂的比例以防止拖尾,结果表明斑点较圆整、无拖尾现象。同时参考文献,采用改良的碘化铋钾试剂作为显色剂,但因其底色较深,不易显现出斑点的颜色,现采用碘-碘化钾试剂取代,斑点较清晰,底色也能渐褪去。

在百部的薄层鉴定中,其有效成分在碱性和酸性条件下均能在氯仿中提取出同一种物质,在供试品的色谱中,在样品(酸、碱)色谱图的相应位置上出现相同的橙红色斑点[8-9]。现利用这一特性对百部进行酸化后再提取,可避免一些在碱性环境中可以被氯仿提取,而在酸性环境中却不溶于氯仿的物质(如苦参)对实验的干扰。

在进行黄柏TLC鉴别中,参考相关文献[6]、[10],用水饱和的正丁醇提取时,所含杂质多,日光下检视不清楚,现改用浓氨试液调节氯仿进行提取,结果杂质较少利于检视,而展开剂属于酸性试剂,因此可先在提取液中加盐酸调为酸性,以利于展开。

洁阴净洗剂为复方制剂,方中干扰成分众多,样品的处理及流动相的选择都很重要。本文对HPLC分析时的流动相系统组成和比例作了比较,对多种溶剂系统进行选择,曾采用乙腈-0.5%冰醋酸溶液、甲醇-乙腈-0.02 mol/L磷酸水溶液,甲醇-不同浓度的磷酸溶液等系统。根据分离情况,选用了乙腈-0.5%冰醋酸溶液(20∶80)测定盐酸小檗碱。

黄柏为洁阴净洗剂的主药,盐酸小檗碱为黄柏的主要成分[2],具有清热燥湿的作用,故以盐酸小檗碱作为本品质量控制的定量指标。本方法简便、灵敏、准确、重复性好,可用于本品的质量控制。

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(收稿日期:2009-05-13)