粘质沙雷氏菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因的体外表达

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摘要：根据GenBank中α-乙酰乳酸脱羧酶的基因序列（slaA）设计引物，以粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）HU1基因组DNA为模板通过PCR扩增得到了目标基因，全长为780 bp。将该基因分别连接到大肠杆菌表达载体pET30a和毕赤酵母表达载体pPICZαA上，构建表达质粒pET30a-slaA和pPICZαA-slaA，并在对应的宿主中进行了表达。结果表明，大肠杆菌和毕赤酵母的表达产物的最适温度和pH均分别为40 ℃和7，两者在不同pH下的稳定性也相似，只不过毕赤酵母的表达产物的热稳定性要略强于大肠杆菌的表达产物。

关键词：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）；α-乙酰乳酸脱羧酶；体外表达

中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2431-04

在啤酒工业中，双乙酰含量是衡量啤酒成熟与否的重要指标，该物质主要由合成缬氨酸的中间产物α-乙酰乳酸在酵母细胞外经非酶氧化脱羧而产生。由于过多的双乙酰会带来令人不愉快的馊饭味，工程技术人员会使用相关的手段和工艺降低啤酒中的双乙酰浓度到一定范围内[1]。α-乙酰乳酸脱羧酶能够降低啤酒发酵过程中产生的双乙酰，缩短熟化期，改善啤酒口味，加速啤酒的成熟。但是啤酒酵母菌自身不能产生α-乙酰乳酸脱羧酶[2]，将α-乙酰乳酸脱羧酶基因整合到啤酒酵母染色体中表达是降低啤酒中双乙酰浓度的措施之一[3-6]。外源表达的α-乙酰乳酸脱羧酶已经作为一种成熟的酶制剂产品被直接应用于生产实践中，可以有效地控制啤酒中的双乙酰浓度。目前国内市场上α-乙酰乳酸脱羧酶的品牌产品很多，国外代表有丹麦的诺维信公司（Novozymes）的产品，国内代表有邢台酶制剂厂、广西大学、南宁富谷科技有限公司以及保定满城金星化工有限公司的产品。本研究从粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）克隆到了α-乙酰乳酸脱羧酶基因，并在大肠杆菌和毕赤酵母中进行体外表达，结果表明该酶具有较为乐观的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 粘质沙雷氏菌HU1、大肠杆菌（Escherichia coli Top10、BL21）、毕赤酵母GS115、质粒pET30a、pPICZαA由湖北大学湖北省工业生物技术重点实验室保存。

1.1.2 酶与试剂 限制性内切酶、DNA快速连接试剂盒、高保真PCR聚合酶Primestar等均购自TaKaRa公司，基因组抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒购自美国Omega生物技术公司，其他抗生素和化学试剂均为国产分析纯或者进口分析纯。

1.1.3 培养基 LB、YPD、MD、BMGY、BMMY见毕赤酵母操作手册。

1.2 方法

1.2.1 α-乙酰乳酸脱羧酶基因的扩增 根据α-乙酰乳酸脱羧酶基因（slaA）序列选择适当的酶切位点设计引物。PCR反应循环条件为：95 ℃，5 min；95 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、60 s，30个循环；72 ℃，7 min。

1.2.2 序列测定与分析 将纯化后的PCR产物连接到pMD18T载体上，构建测序质粒pMD18T-slaA，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，对转化产物进行双酶切鉴定并送至上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.3 α-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的表达及产物鉴定 首先根据测序得到的α-乙酰乳酸脱羧酶基因序列，引入酶切位点Nco I/Hind III设计大肠杆菌表达载体引物。将用该引物扩增得到的PCR产物纯化并双酶切，与经同样的内切酶处理后的载体pET30a连接后转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取转化子并鉴定。将鉴定得到的重组表达质粒pET30a-slaA转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取平板上的单克隆接种于含有卡那霉素的LB培养液中振荡过夜，然后按照体积比1∶50的接种量转接至200 mL的LB培养液中，待培养液吸光度为0.5左右时，于30 ℃用IPTG诱导。用超声波破菌，进行SDS-PAGE电泳[7]。

1.2.4 α-乙酰乳酸脱羧酶基因在毕赤酵母中的表达及产物鉴定 根据α-乙酰乳酸脱羧酶基因设计毕赤酵母表达载体引物，分别引入酶切位点EcoR I/Not I，以粘质沙雷氏菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。将纯化的PCR产物和载体pPICZαA分别用EcoR I和Not I双酶切，然后连接并且转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于含25 mg/L Zeocin的低盐LB培养基上。重组质粒经过PCR和酶切验证后进行测序。将读码框正确的重组质粒电转化于毕赤酵母GS115中，转化条件为1.5 kV、25 μF、200 Ω。将转化细胞涂布在含有100 mg/L Zeocin的YPD平板上，于30 ℃培养2～3 d。随机挑取转化子接种于100 mL BMGY生长培养基中，于30 ℃以220 r/min培养2 d，以5 000 r/min离心10 min，收集菌体，将菌体转移至50 mL BMMY诱导培养基中，用以上条件继续培养，每24 h补加甲醇至终浓度为5%。每12 h取样，以5 000 r/min离心5 min，收集上清液，为粗酶液。

1.2.5 α-乙酰乳酸脱羧酶的活性分析 将大肠杆菌或者毕赤酵母的表达产物用镍凝胶亲和层析法纯化后测定活性，测定方法如下：取150 μL一定浓度的待测样品加入50 μmol/L的磷酸钾缓冲液（pH 6.2），混匀加入50 μL的水解底物溶液，室温放置10 min。立即加入250 μL 2.5 mol/L的NaOH溶液终止反应。在上述反应液中加入4.5 mL肌酸-萘酚溶液，于室温显色反应1 h，测定吸光度[8]。

2 结果与分析

2.1 α-乙酰乳酸脱羧酶基因的PCR扩增及其生物信息学分析

根据Serratia marcescens MG1和S. marcescens H30的α-乙酰乳酸脱羧酶基因序列[9]设计引物，以抽提的S. marcescens HU1总DNA为模板，用引物扩增α-乙酰乳酸脱羧酶基因，扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳分析结果与理论结果吻合。该片断的测序结果表明该基因编码区序列全长为780 bp，编码260个氨基酸。通过PEPTOOL工具分析可知，该α-乙酰乳酸脱羧酶成熟蛋白质的分子质量为28.9 ku，等电点为5.38。BLAST比对结果表明该蛋白质序列与Vibrio cholerae，Klebsiella terrigena和Bacillus subtilis中的α-乙酰乳酸脱羧酶同源性分别达到74%、74%和67%。

2.2 α-乙酰乳酸脱羧酶基因表达质粒pET30a-slaA和pPICZαA-slaA的构建

将扩增的α-乙酰乳酸脱羧酶基因克隆到pET30a载体上，构成重组质粒pET30a-slaA，进行双酶切验证。结果表明重组质粒经Nco I/Hind III双酶切后产生与目的基因同样大小的条带和载体的条带，表明α-乙酰乳酸脱羧酶基因已经成功克隆到pET30a载体中。同样将该基因克隆到pPICZαA上，结果表明，pPICZαA-slaA经过EcoR I/Not I双酶切后产生同α-乙酰乳酸脱羧酶基因同样大小的产物以及载体片段，结果表明α-乙酰乳酸脱羧酶基因已成功克隆到pPICZαA载体中。重组质粒送至上海英骏生物技术有限公司测序，结果表明读码框正确，可以进行下一步的表达试验。

2.3 α-乙酰乳酸脱羧酶表达菌株的构建

将重组质粒pET30a-slaA转化大肠杆菌BL21感受态细胞，在含卡那霉素的LB平板上筛选阳性转化子。将重组质粒pPICZαA-slaA转化毕赤酵母GS115，在含100 mg/L Zeocin的YPD培养基上筛选阳性转化子。酵母转化子通过PCR验证表明基因组中已经整合了α-乙酰乳酸脱羧酶基因。配制含不同浓度Zeocin的YPD培养基，将筛选得到的转化子用影印法依次接种到含250、500、1 000 mg/L Zeocin的平板上，于30 ℃下培养2～3 d，筛选能在高浓度Zeocin下生长的菌株。得到的菌株基因组中可能含有多个拷贝数的α-乙酰乳酸脱羧酶基因。

2.4 α-乙酰乳酸脱羧酶基因的表达与SDS-PAGE分析

含有重组质粒pET30a-slaA的大肠杆菌BL21经诱导表达后，收集细胞，用超声波破碎后进行SDS-PAGE电泳。结果表明，重组菌和对照菌株（pET30a）相比较，在约29 ku处增加了一条蛋白质条带，与预测的基因表达产物一致（图1A）。将在高浓度Zeocin平板上生长的GS115（pPICZαA-slaA）转化子培养在BMMY培养基中，用甲醇诱导3 d，取样离心，上清液进行SDS-PAGE电泳，结果表明，重组毕赤酵母菌株的发酵上清液比对照菌株的发酵上清液多了一个29 ku的蛋白质条带，该条带与目的基因表达产物一致（图1B）。两个试验结果表明α-乙酰乳酸脱羧酶基因的大肠杆菌和毕赤酵母重组表达菌株均已成功构建。

2.5 温度对重组α-乙酰乳酸脱羧酶活的影响

用镍柱将两种宿主表达的酶纯化后，分别在不同的温度下测定大肠杆菌和毕赤酵母表达产物的酶活。由图2A可知，大肠杆菌表达的α-乙酰乳酸脱羧酶的最适反应温度为40 ℃，在50～60 ℃维持40%以上的酶活；由图2B可知，毕赤酵母表达的α-乙酰乳酸脱羧酶的最适反应温度为40 ℃，在50 ℃还有90%以上的酶活。

2.6 pH对重组α-乙酰乳酸脱羧酶活的影响

分别测定大肠杆菌和毕赤酵母表达的重组α-乙酰乳酸脱羧酶在不同pH下的酶活。由图3A可知，大肠杆菌的表达产物的最适反应pH为7，在pH 6、8维持70%以上的酶活，在pH 9维持40%以上的酶活，而pH超过11就基本没有酶活了。由图3B可知，毕赤酵母的表达产物的最适反应pH为7，在pH 6、8可以维持60%左右的酶活，在pH 9～10可以维持30%以上的酶活。

2.7 重组α-乙酰乳酸脱羧酶的温度稳定性试验结果

将纯化后的两种来源的α-乙酰乳酸脱羧酶在不同温度下分别水浴处理0、5、10、15、20、25、30 min，之后测定酶活，以未处理的作为对照，得到α-乙酰乳酸脱羧酶的相对酶活稳定性曲线。由图4A可知，大肠杆菌的表达产物在30 ℃较为稳定，处理30 min时还保持有80%左右的相对酶活；40 ℃时相对酶活就变的十分不稳定，处理30 min后相对酶活只剩10%。而图4B则表明毕赤酵母的表达产物在30 ℃和40 ℃都较为稳定，处理30 min时还保持有70%左右的相对酶活；50 ℃时相对酶活开始变的十分不稳定，处理30 min时相对酶活只剩20%。

2.8 重组α-乙酰乳酸脱羧酶的pH稳定性试验结果

酶经不同pH的缓冲液处理，于4 ℃过夜，测定相对酶活，得到pH稳定性曲线。由图5可知，大肠杆菌表达的重组α-乙酰乳酸脱羧酶相对酶活在pH 5～8的范围内能保持50%以上，而在pH 6～7之间比较稳定，相对酶活保持在80%以上。与之对应的是，毕赤酵母表达产物的pH稳定性与大肠杆菌的表达产物相似。

3 小结与讨论

α-乙酰乳酸脱羧酶已经被广泛地用在啤酒工业中，为此克隆和研究不同来源和性质的α-乙酰乳酸脱羧酶基因具有极大的工业应用价值和经济价值。本研究首次将粘质沙雷氏菌中的α-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母两种宿主中进行了表达，并且研究了其相关酶学性质，结果表明大肠杆菌和毕赤酵母的表达产物的最适温度和pH均分别为40 ℃和7，两者在不同pH下的稳定性也相似，只不过毕赤酵母的表达产物的热稳定性要略强于大肠杆菌的表达产物。这些结论表明大肠杆菌和毕赤酵母表达产物性质并没有很大的区别，这个可能与α-乙酰乳酸脱羧酶基因上没有糖基化位点和其他修饰位点存在有关，因而两种宿主对于该基因的翻译和修饰相近。但是考虑到毕赤酵母能够将外源蛋白分泌到胞外，降低了其后续生产和纯化的难度，节约了成本，从而具有更广阔的前景。研究为将粘质沙雷氏菌中的α-乙酰乳酸脱羧酶应用于啤酒工业打下了基础。

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