黄芩苷对人黑色素瘤A375细胞增殖的影响

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摘 要：目的：探讨黄芩苷对人黑色素瘤a375细胞株体外增殖的抑制作用。方法：选用人黑色素瘤A375细胞进行体外培养，以不同浓度的黄芩苷分别处理黑色素瘤A375细胞，连续6天使用倒置显微镜进行观察，计数，绘制生长曲线；以不同浓度(0．1～50μmol／L)的黄芩苷分别处理黑色素瘤A375细胞细胞24、48、72h后，用MTT法检测细胞生长抑制率；流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：生长曲线及MTT法显示黄芩苷对黑色素瘤A375细胞有抑制作用，并呈剂量和时间依赖性；流式细胞仪检测到细胞在黄芩苷作用后，细胞凋亡率增加。结论：黄芩苷对人黑色素瘤A375细胞具有明显抑制作用，细胞凋亡可能是其机制之一。

关键词：黄芩苷；黑色素瘤A375细胞；MTT

中图分类号：R285.6

文献标识码：A文章编号：1673-7717（2008）11-2510-03

Inhibitory Effect of Baicalim on Human Melanoma A375 Cell Line

KUANG Juxiang1，LEI Peihong2，SHI Jiang1

（1.The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563003，Guizhou,China；

2.Orthopaedics Hospital of Zunyi,Zunyi 563003,Guizhou,China）

Abstract：Objective：To investigate the inhibitory effect of Baicalim on human Melanoma A375 cell line in vitro．Methods:Melanoma A375 cells were cultured invitro and then treated with different concentrations(0.1~50μmol/L) of Baicalim solution.Cells were observed with inverted microscope，the growing curve was drawn．MTT assay was adopted to determine the inhibition rate of Baicalim on melanoma A375 cells；Flow cytometry was used to detect the apoptosis of melanoma A375 cells．Results:The growing curves and MTT assay showed that different concentrations of Baicalim were cytotoxic to melanoma A375 cells in a time-dependent and dose-dependent manner．The FCM analysis showed that the apoptosis rate of melanoma A375 cells was increased after treatment of Baicalim.Meianoma A375 cells presented the characteristic morphological changes of apoptosis under inverted microscope.Conclusion：Baicalim could inhibit the proliferation of human melanoma A375 cells invitro，which way associated with cell apoptosis.

Key words：Baicalim；human melanoma A375 cell line;MTT

黑色素瘤是最常见的皮肤恶性肿瘤，转移早，严重威胁着人类的健康和生命，目前临床尚无根治的有效药物，因此急需寻找有效的治疗药物。中药抗肿瘤的作用日益引起人们的关注，黄芩苷(baicaiim C21H18O11)为黄芩-T-葡萄糖醛酸苷，是从中药黄芩(Scutcllaria Baicalensis Georgi)中提取的。黄芩是我国重要的常用传统中药，是唇形科植物黄芩的干燥根。最早收载于《神农本草经》，列为草根药的上品。它主要含黄酮类化合物，具有广泛药理作用的活性物质，现代药理研究表明黄芩具有抗氧化，抗病毒、抗真菌，抗过敏，抗炎，抗癌等方面的药理作用。研究表明黄芩苷对肝癌、肺癌、子宫癌、卵巢癌等癌细胞有明显抑制作用[1-6]。因此，黄芩苷抗肿瘤作用引起了广泛关注，成为研究的热点。但目前未见黄芩苷对黑色素瘤抑制作用方面的研究报道。因此选择黄芩苷作用于人黑色素瘤A375细胞，本研究旨在初步探讨黄芩苷对A375细胞的生长抑制作用。

1 材料 仪器设备与方法

1．1 材料

黑色素瘤A375细胞株为药理教研室提供；胎牛血清为天津灏洋生物制品有限公司产品；RPMI-1640为北京海克隆生化公司产品；Annexin V-FITC kit为奥地利产品；黄芩苷为四川世坤植化有限公司产品；MTT、DMSO为美国Sigma公司产品；青霉素为哈药集团制药总厂产品；链霉素为华北制药股份有限公司产品；DMSO为成都科龙化工试剂厂产品。

1．2 仪器设备

流式细胞仪(FCM)美国造；酶标仪ST／TC型，中国造；倒置相差显微镜XDS-1B型，中国造；洁净工作台，中国造；CO2培养箱SLshell／JB型，中国造；低速冷冻离心机KDC-2044型，中国造；往复式水浴恒温振荡器SHZ-88A型，中国造。

1．3 方法

1．3．1 细胞培养 将冻存的黑色素瘤A375细胞在37℃快速融解，常规复苏；用含20％胎牛血清的RPMI-1640培养液，放置于37℃，5％CO2培养箱内培养；细胞贴壁大于80％时，传代改用含100IU／mL青霉素和100IU／mL链霉素及10％胎牛血清RPMI-1640培养液继续培养，待用。

1.3.2 显微观察 倒置显微镜观察黄芩苷对黑色素瘤A375细胞生长及形态的影响，将对数生长期的黑色素瘤A375细胞消化后移入离心管离心，1000r／min、5min，然后配制成2．0×105个／mL细胞悬液，接种于24孔培养板中，每孔0.9mL，设空白对照(加PBS)和3个用药组(药物浓度分别为50、10、5μmol/L)各100μL每24h观察细胞形态变化，计数3孔，记录计数结果，计算平均数值，连续计数6天，绘制生长曲线图。见图1。

1．3．3 MTT法测定细胞生长抑制率 取对数生长期黑色素瘤A375细胞，以6×103个／孔加入96孔板，培养板内的细胞按照常规培养于含10％小牛血清并加双抗的RPMI-1640培养液中，37℃，5％CO2下培养24h，细胞贴皿后，加入不同浓度的黄芩苷(药物浓度分别为50、10、5、1、0.1μmol/L)每个浓度设3个复孔；没加药物的细胞作为空白对照组，空白对照孔加入等量PBS。分别培养24h、48h、72h后，加入5mg／mL的MTT 20μL，37℃孵育4h，弃上清，每孔加入150μL DMSO，放置于水浴恒温振荡器内充分振摇，使结晶溶解，上酶标仪在492nm处检测吸光度A值。按下述公式求出生长抑制率(IP)，IP(％)细胞生长抑制率＝(1-实验组平均A值／对照组平均A值)×100％。实验重复3次，取平均值。

1．3．4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 黑色素瘤A375细胞按1×105个／mL接种于6孔板，24h后分别换含50、10、1μmol/L黄芩苷的培养液，对照组换不含药物的培养液。作用2天后，用0．25％胰酶-EDTA消化、PBS洗涤2次后离心，每次1000r／min、5min，弃上清，70％的酒精固定48h后，PBS洗涤去除固定液，碘化丙啶PI和AnnexinV双重染色，200目尼龙网过滤，置流式细胞仪上测定每个样本中的凋亡细胞所占比率。实验重复3次，取平均值。

1．4 统计学处理

统计学软件SPSS12．0处理测得的数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P

2 结 果

2．1 黄芩苷对黑色素瘤A375细胞的生长抑制作用

倒置显微镜下观察显示未用药组细胞贴壁良好，形态正常，黑色素瘤细胞增殖显著；50、10、5μmol／L的黄芩苷对黑色素瘤A375细胞均有抑制作用，且随着黄芩苷浓度的增加和培养时间的延长，抑制作用逐渐增强；用药组细胞随黄芩苷剂量增大，细胞活力降低，部分不能贴壁。结果表明黄芩苷对黑色素瘤A375细胞的生长抑制作用呈时间、剂量依赖性增强，生长曲线具体见图1。

2．2 黄芩苷对黑色素瘤A375细胞的抑制作用

MTT法结果显示0．1～50μmol／L的黄芩苷对黑色素瘤A375细胞均有抑制作用，且随着黄芩苷浓度的增加和培养时间的延长、抑制作用逐渐增强，呈时间、剂量依赖性，具体见表1。

2.3 黄芩苷对黑色素瘤A375细胞凋亡的影响

用黄芩苷50、10、1μmol／L的浓度分别作用于黑色素瘤A375细胞2天后，随着浓度的增强，细胞凋亡率增高，与空白对照组比较，50、10μmol／L组均显著增高，差异有统计学意义（均P0.05），详见图2。

肿瘤细胞的无限增殖是恶性肿瘤的基本特征之一，在肿瘤发展过程中，控制细胞增殖是决定患者预后的一项关键因素。如何抑制癌细胞增生，实现带瘤生存是目前肿瘤治疗研究的热点之一，大量研究表明某些中草药具有抑制肿瘤的作用。黄芩苷是从唇形科植物黄芩中提取、分离出来的一种黄酮类化合物，是黄芩的主要有效成分之一具有解热、降压、利胆、保肝、镇静、抗菌等药理作用。近年来的研究表明，黄芩所含的主要成分黄芩苷能抑制多种肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞分化及促进调亡的作用，如对肝癌细胞株SMMC27721[2]及BEL27402[3]、卵巢癌[5]、人子宫癌Hela细胞株[6]等。黄芩苷抗肿瘤作用表现为抑制癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡，并且呈剂量时间依赖关系[7]。本实验主要观察黄芩苷对黑色素瘤细胞A375细胞增殖的影响。从生长曲线及MTT法结果可见：浓度低于5μmol／L的黄芩苷对黑色素瘤A375细胞的增殖抑制作用不明显，但5μmol／L及更高浓度的黄芩苷可使黑色素瘤A375细胞增殖受到明显抑制，且药物作用效应随着作用时间的延长和药物浓度的增加而增强，提示黄芩苷对黑色素瘤A375细胞增殖有抑制作用，并且具有时间和剂量依赖性。流式检测结果显示10μmol／L及更高浓度的黄芩苷可使黑色素瘤A375细胞凋亡率增加，随着药物浓度增高，细胞凋亡率增加更为显著，细胞凋亡可能是黄芩苷抑制人黑色素瘤A375细胞增殖的作用机制之一。由于黄芩苷能抑制人黑色素瘤A375细胞的增殖，这为临床治疗黑色素瘤提供了更好的前景。

中药活性分析已经发现黄芩苷同时具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗过敏作等多种作用[8-9]，这显示黄芩苷具有更广泛的临床应用价值。黄芩苷抑制人黑色素瘤A375细胞的进一步研究，可为中药黄芩治疗黑色素瘤提供相应的理论资料。

参考文献

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