生存素Survivin与脑胶质瘤的研究进展
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【摘要】 脑胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，呈浸润性生长，预后极差。Survivin基因是凋亡抑制因子家族的一员，具有抗细胞凋亡和调控细胞周期的双重功能，其基因扩增和蛋白的过度表达与肿瘤生长密切相关。因此，Survivin可成为胶质瘤基因治疗的一个新靶点。
【关键词】 脑胶质瘤； 细胞凋亡； Survivin； 治疗
中图分类号 R739.41 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2014）14-0150-04
Progress of Survivin and Glioma/NI Heng，DOU Chang-wu.//Chinese and Foreign Medical Research，2014，12（14）：150-153
【Abstract】 Glioma is the most tumor in brain with infiltrative growth and has a poor prognosis.Survivin is one of inhibitor of apoptosis protein （IAP） family members，it can inhibit apoptosis and regulate cell cycle.The gene amplification and the protein overexpression of Survivin are related closely with tumor growth.So Survivin may be a new target for glioma gene therapy.
【Key words】 Glioma； Apoptosis； Survivin； Therapy
First-author’s address：Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010059，China
胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，居颅内肿瘤发病率的首位，约占颅内肿瘤的35.26%～60.96%（平均44.69%），随年龄增大发病率呈增高的趋势。脑胶质瘤呈浸润性生长，可累及瘤周2 cm以内的正常脑组织[1]，因而早期形成的胶质瘤就具有很强的侵袭能力，从而大大增加了手术根治性切除的难度，即使术后予放化疗，仍不能避免其复发。研究表明，患高级别胶质母细胞瘤的患者平均生存期仅为12～15个月[2]。因此，导致患者死亡的主要原因之一是术后肿瘤的复发。此类肿瘤是神经外科的难题，也是医学研究的重要课题之一。严重危害着人类的健康，而探索其发生和发展的机制，不仅为了更进一步了解肿瘤的生物学行为，也为治疗肿瘤寻找更有效的策略。
肿瘤的发生发展、侵袭转移的过程极为复杂，涉及诸多基因的参与；包括胞外基质降解、瘤细胞脱黏附、瘤细胞运动增强、肿瘤新生血管生成等重要环节[3]。目前国内外已有许多学者关注到这些作用机制，并从不同角度来研究肿瘤的发生发展[4]。目前研究认为由于细胞内多个基因的异常表达，不断累加而导致单克隆肿瘤细胞的产生，并由此不断分裂逐渐形成肿瘤。
1 细胞凋亡与肿瘤治疗
细胞凋亡是受多基因调控，并按程序有规律的死亡，具有其独特的生物学特点。凋亡机制的异常在肿瘤的发生发展中起着重要作用，目前认为这种机制也存在于胶质瘤中。
目前研究揭示，对脑胶质瘤进行放化疗、免疫基因综合治疗，其作用机制均与细胞凋亡有着密切关系。以下做一简单概述。（1）细胞凋亡与脑胶质瘤的化学治疗：有研究表明，胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性下降与其凋亡受抑制有关。例如，作为传统的脑胶质瘤化疗药物亚硝脲类，其阻遏肿瘤细胞DNA烷基化而抑制DNA复制、抑制胶质瘤细胞生长使肿瘤细胞发生凋亡。Winter等[5]将新型辅助化疗药Topotecan加入四个恶性胶质瘤细胞系LN-18、LN-299、LN-308和T98G中，分别于24～72 h观察。这项研究发现肿瘤细胞增殖受抑制，其中部分细胞死亡。最后采用末端标记法检测，发现细胞的死亡形式是凋亡。（2）细胞凋亡与脑胶质瘤的放射治疗：Waldman等[6]通过放射线照射脑胶质瘤细胞后，可观察到胶质瘤细胞的凋亡。（3）细胞凋亡与脑胶质瘤的免疫治疗：目前免疫治疗主要手段是细胞因子诱导细胞的凋亡，如目前临床已用于治疗恶性胶质瘤的TNF-A。Rieger等[7]在用R-INF、A-INF、B-2L和LPS诱导合成NO实验中，发现TNF-A可介导胶质瘤细胞发生凋亡，是通过诱导NO合成酶的基因转录增加，使NO合成酶的表达上调而实现。Fas/Apo-1（CD95）是一种属于介导细胞凋亡的膜蛋白层TNF/NGF家族中的成员。在用人Fas/Apo-1CDNA表达载体转染3个抗胶质瘤细胞系的实验，发现FAS/Apo-1可通过增强细胞表面CD95L的表达，诱导对CD95抗体介导的凋亡，这一作用是通过CD95L诱发细胞产生自杀联级反应来实现。综上所述，Apo-L将有望成为针对脑胶质瘤细胞凋亡治疗的赞新靶点。（4）细胞凋亡与脑胶质瘤的基因治疗：Fueyo等[8]通过细胞实验，把野生型P53转入突变型P53基因的胶质瘤细胞中，结果检测到W-P53的表达增高，大量肿瘤细胞发生凋亡；同时发现，将两种肿瘤抑制基因Rb和W-P53P16进一步转入胶质瘤细胞中，检测到胶质瘤细胞发生凋亡。目前研究表明，成功治疗肿瘤的基础在于诱导肿瘤细胞凋亡，多方法综合治疗亦是治疗肿瘤有效途径；通过选择性干预、诱导肿瘤细胞凋亡的技术有望成为治疗肿瘤的新策略[9]。
综上所述，细胞凋亡是机体的一项重要且极为复杂的生理过程。机体在正常情况下通过细胞自身有程序的死亡消灭细胞分裂周期失调的细胞；而凋亡调控基因的表达异常直接导致了细胞凋亡异常（如细胞促凋亡基因活性受抑制和/或凋亡抑制基因被激活），这使得此类细胞分裂周期失调的细胞逃脱正常的监控机制，长期存活而不能凋亡[10]，导致肿瘤的发生、发展。从某种意义来说肿瘤是细胞增殖和凋亡失衡的一种病理状态。
2 survivin结构及生物学特征
凋亡抑制因子（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）是一类高度保守的内源性抗细胞凋亡因子家族，主要通过参与调解核因子NF-κβ的作用和抑制Caspase活性而抑制细胞凋亡。Survivin是该家族中新发现的成员，拥有调控细胞周期和抗凋亡的双重功能，由Ambrosini等[11-12]于1997年发现，主要表达于胚胎和发育的胎儿组织，也高表达于多数肿瘤组织。Survivin是IAP家族中迄今为止发现的抗凋亡作用最强、分子量最小者。该基因由效应蛋白酶受体EPR-1cDNA在人类基因库
杂交筛选出来，包含三个内含子和四个外显子，定位于人类染色体17q25，编码142个氨基酸。至今已发现4种Survivin的mRNA变体，共产生5种蛋白结构亚型（即Survivin亚型、Survivin-2α亚型、Survivin-2β亚型、Survivin-δEx-3亚型和Survivin-3β亚型）；其中发现Survivin-2β亚型不具有抗凋亡活性，且该亚型很有可能是Survivin的一种天然拮抗剂[13]。而Survivin-δEx-3的抗凋亡活性与Survivin 相同。Survivin仅包含一个部分保守的杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列（baculovirus inhibition apoptosis protein repeat，BIR），BIR序列是一种指环状结构，无梭基末端，该结构是分子量约为16.5KD的胞浆蛋白，PI值为5.74，Survivin蛋白的晶体结构为两性α螺旋相连接，N端结合有Zn2+的BIR结构域与C端65个氨基酸组成的[14-15]；并形成依赖分子间锌原子之间的相互作用的二聚体结构，该二聚体与C端α螺旋相结合形成约70个氨基酸长的疏水表面；该二聚体可阻碍细胞的凋亡，也是保护倍体型所必需的。BIR中含有某些氨基酸残基如：Cys84、Trp67和Pro33等可抑细胞有程序的死亡，Survivin即通过与这些残基结合，作用于凋亡的终末效应酶Caspase-3和Caspase-7，一方面特异性与已经激活的Caspase-3和Caspase-7相结合，结合后很快即失去活性；另一方面Survivin抑制Caspase-3和Caspase-7的自发激活而阻碍细胞的凋亡[13]。Survivin可通过与周期蛋白激酶CDK2和CDK4二者之间的相互作用，阻断细胞凋亡信号转导通路，从而抑制细胞的凋亡[14]。由此可见，Survivin基因的过度表达阻遏了细胞凋亡，使细胞异常增殖和恶性转化，这些机制的揭示，为进一步研究Survivin基因在抑制细胞凋亡中的作用提供了重要的结构基础。
迄今为止发现Survivin可抑制细胞的凋亡可能有多条途径：途径一，通过在上游抑制细胞凋亡信号转导通路，抑制线粒体释放细胞色素C（cytochrome c，Cytc），阻断凋亡终末效应酶caspase活化，从而阻断凋亡信号的传导。Shi[16]通过研究发现，Survivin可能是通过间接抑制caspase-9的活性抑制细胞的自然程序式死亡。途径二，在下游抑制细胞凋亡信号转导通路效应酶caspase活化。Survivin可通过抑制caspase-3、caspase-7的活化，从而抑制细胞的凋亡。途径三，增强IAP家族成员的作用，间接发挥了抗凋亡功能。途径四，参与调节p53依赖的凋亡途径。研究表明，Survivin基因参与了脑缺血后病理生理过程[17]。研究发现Survivin既有抗凋亡作用，又有促进血管再生的作用[18]。这些发现均可为肿瘤的诊疗提供了新靶点。
此外，Survivin在细胞G1 期不表达，而在S期其表达升高6.2倍，在G2-M期其表达可升高40倍；Survivin在G2-M期的表达增高，可调控相应的基因使细胞逃避G2-M期的校正，缩短静止的G1期，使细胞加快向S期转变，促进细胞有丝分裂转化为细胞异常分裂，抑制了肿瘤细胞自身凋亡的发生[19]。
最新研究发现血管的形成也与Survivin有关，Tran等[20]通过用碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）诱导静止期的血管内皮细胞加速分裂，发现在血管内皮细胞中Survivin的表达量升高了16倍，而某些炎症因子、TNF、IL-1均未能诱导血管内皮细胞中Survivin的表达；以上实验提示，介入Survivin的表达和功能的调控环节可以调节血管生成。由此可见肿瘤细胞的浸润可能与Survivin的表达有密切的关系。有学者研究用反义Survivin寡核苷酸作用于内皮细胞，结果发现其可抑制血管内皮生长因子的作用[21]，说明Survivin 可能维持着血管内皮细胞的正常增殖，是血管形成中生长因子诱导的保护性基因。
3 Survivin与脑胶质瘤
Survivin在大脑中主要存在于神经元、脉络丛室管膜细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞中。有研究显示，在正常脑组织中检测不到Survivin蛋白的表达。在脑胶质瘤中随恶性程度增高，Survivin蛋白阳性表达率显著增高，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤中Survivin蛋白的阳性表达率为38.4%、53.1%、75.0%和80.0%，各级别之间的差异有统计学意义（P
Survivin在复发的胶质瘤中较原发胶质瘤中表达显著增强[19-21]。Pan等[23]运用免疫组化实验测定胶质瘤细胞中Survivin的表达，发现随着病理级别升高，核表达增加，核表达水平与肿瘤的分化及复发率有关，而在在胞质中Survivin的表达与临床病理特征无关。Kogiku等[24]的报道与此相一致。康俊龙等[13]研究得出，Survivin蛋白在细胞内的表达和mRNA的表达趋势基本相一致，揭示了人脑胶质瘤在致癌因素的作用下，细胞中Survivin基因的表达可能有不同程度的增加，Survivin mRNA转录增加，进而翻译Survivin蛋白来抑制细胞凋亡，间接促进脑胶质瘤的生长。Survivin蛋白表达量也与患者生存期呈显著负相关[25]。Chakravarti等[26]研究了92例胶质瘤患者，采用Western blot方法检测Survivin蛋白的表达与患者生存期的关系，结果发现Survivin蛋白的表达阳性组患者的生存期明显短于Survivin蛋白阴性组。综上所述，基于Survivin表达的上调导致了胶质瘤细胞凋亡的抑制这种机制，在胶质瘤恶性转化过程中，Survivin基因的表达产物不仅能鉴别组织的良恶性质，也能判断预后，对胶质瘤的诊治具有重要的价值。
4 Survivin与治疗
Survivin在凋亡抑制蛋白家族中活性较强，通过干预Survivin 的表达可促进肿瘤细胞的凋亡。Survivin与药物治疗：（1）cdc2激酶抑制剂：有研究显示，cdc2激酶抑制剂达到诱导肿瘤凋亡、抑制肿瘤生长的目的是通过阻断cdc2对Survivin的磷酸化；（2）抗微管药物：有丝分裂微管与Survivin结合抑制Caspase的活性，如硫酸长春新碱、诺考达唑等抗微管药物即是通过抑制微管和Survivin之间的作用，导致Caspase-2和Caspase-3的活性增加，从而诱导细胞在G2/M期发生调亡；（3）白黎芦醇：黎芦醇是一类肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的增敏剂。有研究表明白，当用其诱导肿瘤细胞在G1期阻滞时，瘤细胞内Survivin表达明显降低，可促进肿瘤细胞更易发生凋亡；（4）Silibinin：Silibinin是目前发现的一种天然的无毒的黄酮类化合物，它亦能使Survivin mRNA和蛋白的表达下调；（5）赫达霉素：赫达霉素可与Survivin启动子结合，阻止Survivin基因转录，最终降低Survivin蛋白的表达[27]。
Survivin与基因治疗：（1）Survivin反义寡核苷酸：研究发现，其作用机制是与细胞内靶基因mRNA结合，利用与该目的基因产生互补的核苷酸片断，并通过空间位阻作用特异激活RNA酶H阻断靶基因的表达。Shankar等[28]用Survivin反义寡核苷酸作用于少突胶质细胞瘤TC620细胞和人神经母细胞瘤MSN细胞，检测到2株细胞中Survivin表达下调、细胞生长减缓、凋亡增加、出现有丝分裂障碍等；Rodel等[29]针对Survivin mRNA设计了ASODN（LY2181308）转染SW480结肠癌细胞，发现转染后的细胞增殖受到显著抑制且呈剂量相关性，进一步发现转染后的细胞在各种剂量辐照下的放射敏感性显著提高。（2）短发卡RNA（shRNA）：通过体外实验研究针对Survivin基因的shRNA，结果显示其能够在体外诱导U251细胞发生大量凋亡；通过比较两种转染细胞，及稳定转染Survivin基因shRNA真核表达载体pWH1-SR的U251-SR细胞和稳定转染空载体pWH1的U251-P细胞，发现前者凋亡细胞约增加6倍[30]。（3）核酶：核酶促使Survivin 表达水平降低，是通过对Survivinm RNA进行切割作用，干扰其蛋白翻译过程而致[31]。（4）转染显性负性突变体：通过实验将表达磷酸化缺陷的Survivin突变体Pad-T34注入肿瘤细胞中，结果检测到肿瘤细胞增殖能力降低，瘤细胞大量凋亡。（5）核糖体：Khanna等[32]的研究显示，从鼠胸腺细胞中提出的S29 cDNA核糖体蛋白，其表达增高可杀死NSCLC的H520细胞株；用蛋白印迹法检测到Survivin蛋白的表达下调[33]。（6）Survivin剪接体：由于Survivin-ΔptEx3和Survivin-2α中BIR被剪短，Survivin-2β中BIR被外显子2β剪断，失去凋亡抑制功能，从而降低肿瘤生长的潜能[34]。
5 展望
胶质瘤的发生发展是一个多基因参与的复杂的过程，探索其发生发展的机制是目前研究的焦点之一。抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的相关研究在肿瘤的基础研究领域中已取得很大进展。干预细胞凋亡通路有望为胶质瘤的诊疗开辟新途径。目前对Survivin的研究仍有待进一步深入，比如Survivin抑制细胞凋亡的确切机制，Survivin与癌基因、抑癌基因和其他凋亡相关基因之间的相互关系，以及针对Survivin基因采取的各种治疗措施等等。由于Survivin在多种肿瘤中高表达，深入研究Survivin的作用机理可为肿瘤的生物学行为提供重要的理论依据，也有望成为诊断胶质瘤的标志物，成为治疗胶质瘤的新靶点。
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（收稿日期：2014-01-17） （编辑：陈春梅）