体外冲击波联合血小板衍生生长因子对成骨细胞促增殖的影响
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【中图分类号】R687【文献标识码】A【文章编号】1005-2720(2009)31 - 1402 - 02
【摘要】目的:探讨冲击波(ESW)联合血小板衍生生长因子(PDGF)对成骨细胞增殖和分泌骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的影响。方法:培养成骨样细胞(MG-63),制备细胞悬液,将细胞悬液分为四组,分别以ESW(A组)、PDGF(B)、ESW与PDGF联合(C)三种方法干预其中三组,另外一组作为对照组(D);给予相应的干预措施后,在37oC 、5%CO2及饱和湿度温箱内培养24、48、72h,MTT法检测细胞活力,ELISA法检测上清液中BMP-2含量。结果:用MTT检测法检测发现四组中以C组细胞活力最强,D组最弱,尤其48小时最明显。各组与C组比较差异有统计学意义(P
【关键词】MG63细胞;PDGF;BMP-2;ESW
有学者研究表明:ESW能使成骨细胞生长因子分泌增加,从而促进成骨细胞增殖。成骨细胞是骨的增殖及细胞外基质形成过程中重要的功能细胞[1]目前对体外冲击波联合血小板衍生生长因子对成骨细胞促增殖的影响报道较少。本实验通过培养成骨样细胞(MG-63)的实验,探讨ESW联合PDGF对成骨细胞增殖作用,为临床治疗骨折延迟愈合或不愈合提供理论依据。
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器:主要仪器:冲击波发生器;倒置显微镜(olympus 日本);高速离心机(山西医科大学中心实验室);细胞培养箱(HERACell-150型,德国)培养瓶、皿(sigma,美国);多孔培养板(sigma 美国);酶标仪(山西医科大学中心实验室);无菌操作台(山西医科大学中心实验室)。主要试剂:MG63细胞(上海中科院细胞库)、IGF-1(SBG)、DMEM(山西医科大学中心实验室)、胰蛋白酶(山西医科大学中心实验室)、BMP-2 ELISA试剂盒(武汉博士得)。
1.2细胞的分离与培养细胞悬液模型制作:体外培养MG63细胞,当细胞长满培养瓶时用胰蛋白酶消化并进行传代,比例约1:3,每两天传代一次,当细胞长满8瓶培养瓶时每瓶细胞用胰蛋白酶消化约一分钟后用DMEM终止。收集各瓶细胞悬液分装到两个15ml离心管中在高速离心机上1000r/min离心5分钟,收集上清液并用细胞计数板调整细胞密度为1×10^6cells/ml,然后分装4个螺旋帽细胞管中,放在预制的冲击波接收架上等待冲击波干预。
1.3模型的分组及干预:将制备的细胞悬液模型分为A:ESW组、B:PDGF组、C: ESW联合PDGF组D:对照组,A、C组使用冲击波发生器施加最佳能流密度0.16mj/mm2,即5kv、100频次的冲击波干预,对照组不施加干预,PDGF组加入细胞因子PDGF,调整密度为10ng/ml,抽取各组细胞部分悬液接种到96孔板上,每组设4个复孔,重复三次,剩余的细胞悬液分别接种到24孔板上,每组6孔,置于37摄氏度、5%CO2及饱和湿度条件的孵育箱培养。
1.4 MTT法测定细胞活性:分别于培养24小时、48小时72小时后取出96孔板,弃原培养液,每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h后终止培养,小心吸去孔内培养液每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
1.5 ELISA法测定BMP-2含量: 分别于24小时和48小时72小时取出24孔板,收集培养上清液,-20℃保存备用。采用酶联免疫试剂盒,按试剂说明进行检测,酶标仪测定各组OD值。
1.6 统计分析:实验结果以SPSS13.0数据统计软件包处理,结果用均数±标准差(x±s),采用2×2析因设计,组间两两比较采用LSD法。P
2.结果:
2.1 ESW、PDGF、ESW联合PDGF对细胞活力的影响见表1。
表1 ESW、PDGF、ESW联合PDGF对细胞活力的影响(OD值)
结论:不同组别的MTT比较ESW联合PDGF组活力最强,与各组差别有统计学意义。
2.2 ESW、PDGF、ESW联合PDGF组BMP-2含量值见表2。
表2 ESW 、PDGF、ESW联合PDGF 各组中BMP-2含量值(0D值)
结论:不同组别BMP-2含量比较:ESW联合PDGF组活力最强,与各组差别有统计学意义。
3 讨论:
3.1 冲击波对成骨细胞增殖的促进作用。
有学者发现,在使用冲击波治疗小儿泌尿系结石的过程中,经冲击波治疗的患者肾功能未发现损害,而且较对侧肾发育较快,因此联想到冲击波是否能促进组织增长。本实验用MTT法、ELISA检测法,检测细胞活力和BMP-2表达时发现:ESW(A)组与对照组(D)比较,其细胞活力及BMP-2表达较高,说明体外培养的成骨细胞在ESW干预下增殖效应增强。李晓林等[6]发现,由于冲击波刺激了骨小梁周围成骨细胞中的骨形态发生蛋白呈强阳性表达,骨折部位纤维、软骨骨化,从而使骨折愈合。Wang CJ等认为[2]体外冲击波疗法能改善治疗局部的血液循环,促进病变区域的新陈代谢,从而改善成骨细胞增长的局部微环境,从而促进了成骨细胞的增值。还有学者认为:[3]对于骨细胞来说, 中、高剂量的刺激在远期效应上可促进细胞增殖。许多临床工作者通过实验发现:[4]冲击波疗法在诱导成骨过程中起重要作用,冲击波导致组织发生微创,微小骨折及血肿形成,诱导血管化发生,增强膜内化骨及加速软骨内化骨。以上观点都支持本实验结果。
3.2 PDGF对成骨细胞增殖的影响。
血小板衍生生长因子(PDGF)是一种可促进多种细胞增殖的生长因子,在骨组织中丰富,他是由两条肽链组成的3种二聚体结构:PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB。由于骨的形成是在多种生长因子相互作用的网络调节下实现的,目前关于生长因子在调节成骨细胞代谢中的相互作用关系尚不完全清楚。因此本实验采用PDGF作用于成骨细胞,并用MTT法、ELISA法检测细胞活力和BMP-2表达,取得相关数据后发现PDGF(B)组较对照组(D)细胞活力强、BMP-2表达高。得出结论:PDGF作用于成骨细胞后,加强了成骨细胞的增值。有学者研究表明:PDGF可促进骨细胞DNA的合成和细胞复制,加速骨质形成。[5]Mott DA[6]等人通过实验证实PDGF可间接增加胶原蛋白的合成,它是通过刺激细胞增殖数目来增加胶原合成。这些学者实验结果支持本实验结果。
3.3 ESW联合PDGF加强成骨细胞增殖作用
我们在实验中用MTT法检测细胞活力时发现,单纯ESW、PDGF和联合组对成骨细胞增殖均有作用,但其中联合组的细胞增殖较其余各组强,在细胞培养48小时后达到高峰。同时在做成骨关键因子BMP-2检测时,BMP-2分泌最多也在联合组中,高峰也在48小时。由此可见,ESW联合PDGF较单纯ESW、PDGF对成骨细胞增殖作用强。但对于二者联合后的作用机制还不能完全清楚,我们认为可能是由于冲击波作为一种物理刺激携带巨大的能量作用于成骨细胞,加强了代谢,促进成骨;同时促进了关键因子BMP-2的分泌,再加上PDGF作为一种增殖促进剂,作用于成骨细胞,进一步改善了细胞增殖的微环境,有利于成骨细胞增殖。在体内,成骨细胞增值受到多种因素的影响,(如骨组织局部血液供应、局部生长因子的分泌等等)是一个复杂的过程,本实验运用体外培养成骨细胞,不能完全模拟体内环境,因此还存在一些问题需要改进。
综上所述,目前虽然细胞生物学技术高速发展,人们对于细胞因子的认识也逐渐深入,其促进成骨细胞增值的作用已经有学者证实,但就其在临床骨折不愈合或延迟愈合治疗中的应用尚需进一步探讨;同时许多学者认为体外冲击波治疗对骨折不愈合和延迟愈合有治疗作用;需要进一步了解的是能否将冲击波的物理作用与细胞因子生物学作用结合加强促进骨折愈合的作用。总之,随着基础实验的深入研究及在临床中的应用,其前途是光明的,将为骨折不愈合或延迟愈合的治疗提供一种全新的方法。
【参考文献】
[1] VAN DER PLAS A, N IJWEIDE P J. Cells in ceractions in the osteogenic compartment of bone [J]. Bone,1998,9 (2): 107.
[2] Wang CJ, Wang FS, Yang KD, et al. Shock wave therapy induces neovascularization at the tendon-bonejunction.Astudyinrabbits [J]. Orthop Res,2003, 21(6):984-989.
[3] 中国科技信息.2006,2.
[4] 中国矫形外科杂志.2005,10,13(20).
[5] 中国骨肿瘤骨病.2006年10,5(5).
[6] Mott DA,Mailhot,Cuenin MF,etal. Enhancement of osteoblast proliferation in vitro by selective enrichment of demineralized freeze-dried bone allograft with specific growth factors.J Oral Implantol,2002,28:57-66.